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來源：藥聞窗
基因編輯有望治愈先天性疾病
隨著人類基因組測(cè)序的完成、高效基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，針對(duì)基因水平的準(zhǔn)疾病治療逐漸走入大眾的視野?；蚓庉嬛饕咐没蚬こ淌侄螌?duì)核酸序列DNA或RNA進(jìn)行修飾，從而實(shí)現(xiàn)靶基因的定向改變，如基因插入、刪除和置換等，最終獲得所需要的新性狀。
基因編輯治療為解決困擾人類已久的先天疾病帶來希望。由于許多先天疾病是由遺傳基因異常導(dǎo)致的，因此長久以來，人類無法根治這一類型的疾病?；蚓庉嬁梢陨钊氩≡矗瑤碇斡南Ｍ?。
01
基因編輯給先天性疾病帶來希望
基因是決定生物表征的重要因素。一般將基因?qū)挿豪斫鉃榇鎯?chǔ)生物遺傳信息的載體?；虻拇嬖谑股锬軌虮Ａ魞?yōu)勢(shì)表征，是高級(jí)生物出現(xiàn)的基礎(chǔ)。但是基因的遺傳也伴隨著大量的不確定性，不確定性來自于生物活動(dòng)的隨機(jī)性，不確定性帶來了進(jìn)化的可能性，同時(shí)也帶來了疾病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于大部分有性繁殖生物來說，基因一半來自父親一半來自母親，因此后代可能因?yàn)榛虻募兒匣螂s合導(dǎo)致父輩中未曾出現(xiàn)過的疾病。
在人類以往的歷史中，基因疾病往往難以治愈。由于基因深藏于人類身體最深處，難以從源頭解決問題，通常需要長期服藥以控制疾病進(jìn)展，疾病負(fù)擔(dān)較重。同時(shí)，許多基因疾病屬于罕見病，治療方案十分有限，導(dǎo)致較高的藥物價(jià)格和較低的可及性，屬于未被滿足的醫(yī)療需求。
隨著基因編輯工具的不斷進(jìn)步，基因編輯療法也進(jìn)入了發(fā)展的快車道。TALEN、ZFN，以及幾乎革新了整個(gè)基因編輯領(lǐng)域的CRISPR-Cas系統(tǒng)使基因編輯療法變得觸手可及。2020年，來自加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna教授和普朗克研究所的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。與此同時(shí)，J. Doudna教授作為共同創(chuàng)始人成立的Intellia Therapeutics，E. Charpentier作為共同創(chuàng)始人成立的CRISPR Therapeutics已成長為基因編輯治療領(lǐng)域的領(lǐng)軍者，兩家公司均已有管線進(jìn)入臨床階段，有望在不久的未來，為困擾人類已久的基因疾病治療帶來曙光。同時(shí)，基于基因編輯技術(shù)，方興未艾的細(xì)胞治療也有望迎來跨越式的發(fā)展。
02
DNA缺陷伴隨一生且可能影響后代
DNA通過蛋白控制影響著身體的活動(dòng)和表征。DNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程分為兩大步，第一步：DNA轉(zhuǎn)化為mRNA，這一步驟稱為轉(zhuǎn)錄（transcription），發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)；第二步：mRNA 轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，這一步驟稱為轉(zhuǎn)譯（translation），發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。mRNA是DNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的中間體，這也是它名稱的由來，即信使RNA（messenger RNA）。
通俗來講，DNA類似于底稿，DNA發(fā)生的改變會(huì)一直存在于體內(nèi)，由此細(xì)胞分裂新產(chǎn)生的細(xì)胞也會(huì)繼承這些改變，因此DNA的改變有很大概率會(huì)伴隨一生，其中性細(xì)胞中DNA的變化甚至能夠遺傳至下一代。同時(shí)部分DNA片段會(huì)影響mRNA產(chǎn)生的速率與表達(dá)量。mRNA類似于說明書，能夠指導(dǎo)自身細(xì)胞生產(chǎn)出特定的蛋白。蛋白則是最終生產(chǎn)得到的工具，對(duì)生物個(gè)體的各項(xiàng)指標(biāo)直接產(chǎn)生作用。mRNA或蛋白的變化不會(huì)被繼承或遺傳。這一條轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯鏈被稱為生物學(xué)“中心法則”（The Central Dogma）。
圖1 中心法則：DNA-mRNA-蛋白轉(zhuǎn)化過程
03
DNA與基因疾病和遺傳性疾病
根據(jù)美國國家癌癥研究院的定義，遺傳遺傳性疾病（hereditary syndrome）通常指部分或完全由具有遺傳性的基因或染色體異常導(dǎo)致的疾病。根據(jù)美國國家人類基因研究院的定義，基因疾?。╣enetic disorder）指完全或部分由于DNA序列異常導(dǎo)致的疾病。遺傳性疾病和基因疾病雖然不完全相同，但包含了很多重疊的病癥。
DNA作為人類遺傳物質(zhì)的存儲(chǔ)載體，深藏在細(xì)胞核中。一方面受到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和人體免疫機(jī)制的層層保護(hù)，不易發(fā)生改變；但另一方面，在出現(xiàn)基因異常時(shí)，現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)技術(shù)也難以提供有效的治療方案。同時(shí)，DNA異常通常會(huì)伴隨患者一生，且有很大幾率遺傳至后代。因此，患者疾病負(fù)擔(dān)大，且缺乏有效的治療手段。
除此之外，許多罕見病是由基因缺陷造成的。大部分具有缺陷的基因，會(huì)導(dǎo)致基因的攜帶者難以生存。由于基因是遺傳信息載體，因此在長時(shí)間的自然選擇中，這類基因難以被繼承，所以許多基因疾病/遺傳疾病都屬于未被滿足的醫(yī)療需求。
04
基因編輯的作用原理
基因編輯工具使人類擁有了定向改變DNA 或RNA 的能力。通過插入、刪除、替代特定位點(diǎn)的核苷酸，我們能夠改變基因表達(dá)，進(jìn)而長久地影響蛋白序列或結(jié)構(gòu)。援引發(fā)表在Yale Journal of Biology and Medicine 上的文章“Genome Editing: Past, Present, and Future”的內(nèi)容，歷史上，人類不斷探索能夠改變基因的方式。在20 世紀(jì)時(shí)，人類曾通過化學(xué)療法、放射療法改變腫瘤細(xì)胞的DNA，擾亂腫瘤細(xì)胞的生命活動(dòng)，以此消滅腫瘤。但這2 種方法造成的基因變化是隨機(jī)的，且難以精準(zhǔn)定位。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)明了3 種重要的基因編輯工具：鋅指（ZFN）、TALEN、CRISPR?，F(xiàn)代基因編輯工具的出現(xiàn)不僅大大加速了科學(xué)研究，同時(shí)也給許多基因疾病的治療帶來的可能性。
精準(zhǔn)定位是基因編輯的重要能力，是實(shí)現(xiàn)定向編輯的第一步。靶向特定目標(biāo)序列，而不是在DNA任意位置隨意更改，使基因編輯成為可控的工具，并且規(guī)避不受控的基因突變帶來的風(fēng)險(xiǎn)。不受控制的基因突變或不夠精準(zhǔn)的基因修改，常常會(huì)帶來無法預(yù)測(cè)的腫瘤、免疫疾病等惡性病癥。
在精確定位的基礎(chǔ)上，一個(gè)好的基因編輯工具還應(yīng)該能夠識(shí)別并定位到任意的設(shè)定序列。這樣基因編輯才能夠廣泛應(yīng)用于不同的基因疾病。
許多基因疾病是由DNA 的錯(cuò)誤表達(dá)或過度表達(dá)引起的。通過基因敲除或抑制，便能達(dá)到較好的治療效果。因此，僅僅依靠基因編輯工具進(jìn)行定位，同時(shí)引入可控的酶在這一位點(diǎn)進(jìn)行切割，便能大大緩解乃至治愈這類疾病。目前，大部分體內(nèi)基因編輯療法便是利用這一機(jī)理，對(duì)致病基因進(jìn)行定向敲除，達(dá)到治療目的。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)開始了基因敲入的研發(fā)。相較于基因敲除，基因敲入更為復(fù)雜，往往需要基因編輯工具以及基因插入技術(shù)（例如病毒載體插入技術(shù)）共同完成，因此目前的進(jìn)展落后于基因敲除療法。但基因敲入帶來了更多治愈疾病的可能性，尤其對(duì)于部分由基因過少或缺失表達(dá)引起的疾病。
05
基因編輯具有永久有效的潛力
雖然名稱相似，但基因編輯（gene editing）與基因治療（gene therapy）有著本質(zhì)的不同。
基因編輯，通過對(duì)基因進(jìn)行改造，糾正錯(cuò)誤的基因。由于這一改變發(fā)生在原本的基因組中，因此，就算細(xì)胞發(fā)生了分裂，這一改變也會(huì)被繼承。因此，基因編輯通常被認(rèn)為具有永久糾正致病基因的潛力。更進(jìn)一步，若這一改變發(fā)生在性細(xì)胞中，則這一改變將可能被后代繼承。
基因治療，則是通過遞送額外的基因進(jìn)入細(xì)胞，使得細(xì)胞能夠額外表達(dá)上述基因，但并不改變此前已經(jīng)存在的基因。新的基因也不會(huì)被整合進(jìn)入原本的基因組中，因此，在細(xì)胞發(fā)生分裂后，這一改變也不會(huì)被繼承。理論上來講，相較于基因編輯，基因治療的持久性稍差。
圖2 基因治療 vs. 基因編輯治療
06
基因編輯工具：CRISPR
人類對(duì)生物醫(yī)藥的探索不斷，所掌握的藥物種類不斷豐富。從小分子化學(xué)藥到生物藥、核酸干擾藥物（RNAi）、基因治療、基因編輯治療。隨著藥物種類的豐富，治療能夠觸達(dá)的靶點(diǎn)也更為廣闊：小分子化學(xué)藥和生物藥（單抗、雙抗等）作用于蛋白質(zhì)，RNAi 作用于RNA，基因治療和基因編輯作用于DNA。
圖3 藥物迭代史
TALEN，Transcription Activation-Like Effector Nucleases，是一種限制性酶。通過工程化改造后，具有切割DNA鏈特定位點(diǎn)的能力。TALEN主要分為2個(gè)功能域：DNA結(jié)合域（DNA binding domain）和DNA切割域（DNA cleavage domain）。
DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)識(shí)別位點(diǎn)，引導(dǎo)切割酶至正確的編輯位點(diǎn)。DNA結(jié)合域的核心部分由相連的數(shù)個(gè)重復(fù)的氨基酸序列片段組（tandem amino acid repeats）組成，每個(gè)氨基酸片段組由33-34個(gè)單位的氨基酸構(gòu)成，每個(gè)片段組對(duì)應(yīng)DNA鏈上的1個(gè)堿基。每個(gè)氨基酸片段組的序列基本相同，除了第12-13個(gè)氨基酸不同，這兩個(gè)位點(diǎn)被稱為repeat-variable diresidue（RVD）。正因?yàn)檫@2個(gè)位置的氨基酸可變，因此通過控制這兩個(gè)位置的氨基酸，基因編輯工具可以靶向DNA的4種不同堿基。每個(gè)片段組對(duì)應(yīng)1個(gè)DNA堿基，數(shù)個(gè)前后銜接的片段組便可以靶向特定的DNA序列。
圖4 TAL Effector結(jié)構(gòu)
圖5 TAL Effector中一個(gè)repeat單位的蛋白三維結(jié)構(gòu)示意圖
DNA切割域在DNA結(jié)合域的幫助下，來到選定的位點(diǎn)進(jìn)行切割。FokI內(nèi)切酶是常見的切割工具。FokI 需要形成二倍體（dimer）來進(jìn)行切割，因此TALEN通常由2條分別靶向DNA正鏈和反鏈的TALEN組成。TALEN將會(huì)切割2個(gè)靶向序列之間的位置。
圖6 TAL Effector + FokI 二倍體
優(yōu)勢(shì)：
相較于ZFN，TALEN 靶向性更強(qiáng)，毒性較?。赡苡捎诟鼫?zhǔn)確的親和導(dǎo)致）。
相較于ZFN，TALEN 不需要選擇或定向進(jìn)化，節(jié)省構(gòu)造時(shí)間和成本。
相較于CRISPR，TALEN 不需要PAM 序列，理論上可選擇的靶點(diǎn)更多。（但由于基因組中通常有多個(gè)潛在有效靶點(diǎn)，因此這一優(yōu)勢(shì)并不突出）。
劣勢(shì)：
TALEN 結(jié)構(gòu)較大，對(duì)遞送提出了較高的要求。常見的病毒載體慢病毒（lentivirus）和腺相關(guān)病毒（AAV）難以運(yùn)送這么大分子量的“貨物”。目前科學(xué)家嘗試以mRNA 的方式遞送TALEN。
相較于CRISPR，TALEN 的制造流程相對(duì)復(fù)雜，成本較高。
相較于CRISPR，TALEN 的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)更為復(fù)雜。CRISPR 僅需重新構(gòu)建gRNA 序列即可，而TALEN 需要考慮DNA 結(jié)合等因素。
CRISPR，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，來源于細(xì)菌和其他微生物。
CRISPR 是細(xì)菌對(duì)抗病毒入侵的重要免疫機(jī)制，通過識(shí)別病毒基因序列，CRISPR 可以引導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)的生物機(jī)制對(duì)病毒基因序列進(jìn)行摧毀和消滅，使病毒無法在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制繁殖。
CRISPR是細(xì)菌基因組內(nèi)的一片由短小DNA重復(fù)片段（回文）和spacer組成的區(qū)域。當(dāng)某一種類病毒首次入侵時(shí)，病毒的部分基因片段會(huì)被整合存儲(chǔ)在spacer中。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄（transcription）和各類蛋白的處理，帶有病毒基因序列的CRISPR RNA（crRNA）形成，并引導(dǎo)分子切割機(jī)制對(duì)病毒基因進(jìn)行切割。由于序列直接由病毒基因復(fù)制得到，因此crRNA與病毒基因的識(shí)別匹配程度非常高。
圖7 CRISPR 對(duì)抗病毒入侵機(jī)制
CRISPR機(jī)制賦予了一個(gè)可靠的定位機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，一個(gè)完整的基因編輯工具還需要切割機(jī)制來對(duì)DNA 鏈進(jìn)行切割。自然界中， 細(xì)菌的CRISPR免疫系統(tǒng)中包含的Cas家族基因（CRISPR-associated gene）便可以完成這一工作。Cas家族中包含多個(gè)不同的基因，擁有不同的功能或切割方式。
gRNA負(fù)責(zé)是CRISPR基因編輯的定位器。gRNA由crRNA和tracrRNA組成。crRNA攜帶有目標(biāo)序列的RNA。crRNA和tracrRNA形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，科學(xué)家進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將crRNA和tracrRNA相連，并不影響整體機(jī)制的運(yùn)作和活性。形成的單鏈gRNA（sgRNA）更為便捷。
Cas蛋白是負(fù)責(zé)切割DNA鏈的剪刀。Cas蛋白中，HNH域負(fù)責(zé)切割靶序列，RuvC域負(fù)責(zé)切割靶序列的互補(bǔ)鏈。切割位點(diǎn)與PAM序列相關(guān)。
此前CRISPR無法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用，原因是CRISPR-Cas系統(tǒng)無法穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核。張鋒團(tuán)隊(duì)在Cas 蛋白序列上添加了NLS（Nuclear localization sequence），NLS與入核載體相互作用，將Cas運(yùn)載進(jìn)入細(xì)胞核。
優(yōu)勢(shì)：
易于操作，簡(jiǎn)單便捷。
設(shè)計(jì)空間大，基本可以靶向任何靶點(diǎn)序列。
成本較低。
gRNA和Cas可以拆分遞送。
劣勢(shì)：
CRISPR的gRNA長度有限制，可能導(dǎo)致脫靶事件出現(xiàn)。
07
基因編輯治療路徑
基因編輯治療根據(jù)基因編輯發(fā)生的場(chǎng)景主要分為2 條路徑：體內(nèi)（in vivo）和體外（ex vivo）。
圖8 基因編輯治療的2 條路徑
體內(nèi)基因編輯指將基因編輯工具遞送進(jìn)入患者體內(nèi)，基因編輯發(fā)生在人體內(nèi)。而顧名思義，體外基因編輯治療中，基因編輯發(fā)生在體外（例如實(shí)驗(yàn)室等），通常需要提取患者細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)患者細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，再將經(jīng)工程化改造后的細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)。整體流程類似于現(xiàn)有的CART細(xì)胞治療。
兩條路徑各有優(yōu)勢(shì)，也各有不同的技術(shù)挑戰(zhàn)。目前來看，采用體外基因編輯路徑的公司相對(duì)更多。
這一選擇可能是由于體內(nèi)基因編輯對(duì)安全性的要求更高、技術(shù)難度更大。
體內(nèi)基因編輯相較于體外基因編輯難度更高，而體內(nèi)基因編輯中，基因敲入比基因敲除難度更高。因此，基因敲入所需掌握的技術(shù)復(fù)雜，要求高。因此目前進(jìn)展也落后于其他路徑。
從步驟上來看，基因敲除通過CRISPR系統(tǒng)gRNA和Cas在特定位點(diǎn)剪切DNA鏈，造成雙鏈斷裂（DSB），使靶點(diǎn)基因無法正常表達(dá)。根據(jù)Intellia的設(shè)計(jì)思路，基因敲入同樣需要CRISPR系統(tǒng)先剪切DNA雙鏈，再通過病毒載體（Intellia目前使用的是腺相關(guān)病毒AAV作為載體）在剪切位置插入缺失的基因。
因此基因敲入由2個(gè)部分組成。第一部分由LNP作為遞送系統(tǒng)包裹用于定位的gRNA和編碼Cas（用于切割）的mRNA，在設(shè)定位點(diǎn)進(jìn)行切割。第二部分由病毒載體作為遞送系統(tǒng)，將患者缺失的基因遞送進(jìn)入細(xì)胞核，并整合進(jìn)患者基因中。
圖9 體內(nèi)基因編輯-敲入治療實(shí)現(xiàn)路徑
相較于體內(nèi)編輯，體外基因編輯是競(jìng)爭(zhēng)者較多的細(xì)分賽道。主要原因是體外基因編輯可以通過質(zhì)量控制保證基因編輯的質(zhì)量，將不達(dá)標(biāo)的細(xì)胞去除，從安全性的角度來看更為可靠，也更容易被監(jiān)管機(jī)構(gòu)所接受。
從某個(gè)角度來說，體外基因編輯是利用基因編輯工具賦能細(xì)胞治療。目前的細(xì)胞治療，受制于細(xì)胞免疫機(jī)制，以自體型為主。排異反應(yīng)來自多個(gè)人體免疫機(jī)制，例如T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞（與HLA 基因相關(guān)）。同時(shí)，若輸注的治療細(xì)胞量較大的話，輸注細(xì)胞可能會(huì)對(duì)人體細(xì)胞產(chǎn)生排異（與TCR 相關(guān)）（GvHD）。通過基因編輯，盡量干擾或阻斷引起排異反應(yīng)的信號(hào)通路。
Intellia 在此提供了一些可能的改進(jìn)思路。例如：通過敲除治療細(xì)胞的TCR 來避免移植物排斥宿主?。℅vHD）；通過基因敲入引入CAR 或TCR 來增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷；敲除II 型HLA 基因來避免CD-4 介導(dǎo)的排異反應(yīng)；敲除HLA-A 來避免CD-8 介導(dǎo)的排異反應(yīng)；調(diào)整HLA-B 和HLA-C 來避免NK 細(xì)胞介導(dǎo)的排異反應(yīng)。