EN
來源：醫(yī)麥客
與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞因其多重殺傷機(jī)制、更高的安全性和廣泛的供源備受關(guān)注，目前的研究已經(jīng)證明了其中的安全性和可行性，NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫療法已成為一種便捷有效的癌癥治療方法。
與T細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制不同，NK細(xì)胞僅憑對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別便可啟動(dòng)殺傷過程。NK細(xì)胞的殺傷活性受細(xì)胞表面的抑制性受體和激活性受體的共同調(diào)控，當(dāng)激活與抑制的平衡被打破，NK細(xì)胞便會(huì)行使相應(yīng)的功能。當(dāng)靶細(xì)胞表面表達(dá)足夠的抑制性配體時(shí)，NK細(xì)胞的功能是受到抑制的；而當(dāng)靶細(xì)胞表面的激活性配體表達(dá)量發(fā)生上調(diào)、或當(dāng)靶細(xì)胞表面的抑制性配體的表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)時(shí)，NK細(xì)胞的殺傷功能就會(huì)得到激活。
NK細(xì)胞主要通過三種機(jī)制殺傷靶細(xì)胞：1.通過釋放含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞質(zhì)顆粒直接殺傷靶細(xì)胞；2.釋放細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，通過與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體的相互作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；3.Fc受體CD16與抗體的Fc段結(jié)合，可激發(fā)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）來殺傷細(xì)胞。
▲ NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性機(jī)制
而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）是由山中申彌于2006年將轉(zhuǎn)錄因子引入細(xì)胞形成，這項(xiàng)技術(shù)與NK細(xì)胞結(jié)合后，衍生的iPSC-NK具有更加成熟的表型和有效的細(xì)胞溶解活性，且iPSC提供了可以擴(kuò)展到臨床規(guī)模的同質(zhì)CAR-NK細(xì)胞群。因此，CAR-iNK細(xì)胞成為用作癌癥免疫治療的標(biāo)志性“現(xiàn)存”產(chǎn)品。
▲ iPSC衍生的CAR-NK細(xì)胞的產(chǎn)生
強(qiáng)化iPSC-NK細(xì)胞功能有以下策略
融合構(gòu)建體增強(qiáng)安全性
IL-15是NK細(xì)胞存活的必要條件，但在NK細(xì)胞培養(yǎng)的過程中會(huì)導(dǎo)致外周NK細(xì)胞擴(kuò)增并誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)，從而導(dǎo)致全身毒性。因此研究人員利用了iPSC易進(jìn)行基因改造的優(yōu)勢(shì)，將特定的融合構(gòu)建體（IL-15RF）導(dǎo)入iPSC中，通過修飾iPSC來進(jìn)一步增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能，從而增強(qiáng)iPSC-NK細(xì)胞的毒性和持久性。
引入CD16a提高存活率
NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC受到受體CD16a調(diào)節(jié)，將高親和力、無法裂解的受體CD16a引入iPSC，提高iPSC-NK細(xì)胞對(duì)活化誘導(dǎo)的CD16a裂解和ADCC效應(yīng)的抗性，顯著提高惡性血液病和實(shí)體瘤異種移植模型的存活率。
基因編輯手段
CD38作為雙功能胞外酶而同時(shí)具有環(huán)化酶和水解酶的活性，廣泛作用于多種免疫細(xì)胞表面，通過特定的基因編輯使NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的先天免疫功能、ADCC、持久性以及與適應(yīng)性NK細(xì)胞相關(guān)的代謝和轉(zhuǎn)錄特征，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，種種證據(jù)都在支持國(guó)內(nèi)外的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)一步開發(fā)iPSC-NK細(xì)胞用于腫瘤免疫治療。
如何利用CAR工程進(jìn)一步提高iPSC-NK細(xì)胞腫瘤靶向性和細(xì)胞毒性
CAR-iNK細(xì)胞療法
嵌合抗原受體可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的特異性抗原，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)，該作用已被開發(fā)用于進(jìn)一步改善細(xì)胞毒性功能和NK細(xì)胞抗腫瘤作用，在規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，CAR-iNK細(xì)胞療法也保留了CAR-T細(xì)胞療法的抗腫瘤活性。在異種移植的情況下，細(xì)胞因子釋放的更少，體內(nèi)外抗腫瘤活性總體也就更高。CAR-iNK細(xì)胞的臨床療效極大鼓舞了國(guó)內(nèi)外的研究人員，各種來源的CAR-iNK細(xì)胞的臨床試驗(yàn)已經(jīng)展開，期待CAR-iNK細(xì)胞療法將免疫細(xì)胞療法帶入一個(gè)新時(shí)代。
用CAR構(gòu)建iPSC細(xì)胞用于免疫治療
iPSC可以與CAR一起進(jìn)行基因工程改造（CAR-iPSCs）。目前用于NK細(xì)胞的大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)都針對(duì)增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和增殖來設(shè)計(jì)，為了優(yōu)化這類NK細(xì)胞的功能，國(guó)外一家研究機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)并篩選了一種NK細(xì)胞特異性CAR結(jié)構(gòu)（NK-CAR）。與CAR-T細(xì)胞相比，NK-CAR修飾的iPSC-NK（NK-CAR-iNK）細(xì)胞能夠在卵巢癌異種移植模型中有效地抑制生長(zhǎng)并延長(zhǎng)存活時(shí)間，避免患者體重減輕、器官損傷或出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征。這些結(jié)果表明NK-CAR-iNK細(xì)胞治療比傳統(tǒng)的CAR-T療法更安全有效。因此，合適的CAR構(gòu)建體對(duì)于提高CAR-iNK細(xì)胞的抗腫瘤能力功不可沒。
多功能裝備下的CAR-iNK細(xì)胞
除了用CAR來設(shè)計(jì)iPSC以外，許多研究機(jī)構(gòu)也在嘗試其他方向的基因修飾以進(jìn)一步提高CAR-iNK細(xì)胞的功能，國(guó)外一家機(jī)構(gòu)創(chuàng)建了一個(gè)三重基因修飾的CAR-iNK（iDuo-NK）細(xì)胞，使其在淋巴瘤和白血病中表現(xiàn)出持久的應(yīng)答。為進(jìn)一步探討CAR-iNK細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用，該機(jī)構(gòu)還設(shè)計(jì)了一個(gè)四倍基因編輯的CAR-iNK細(xì)胞，被稱為 iDuo-MM-CAR-NK細(xì)胞。iDuo-MM-CAR-NK細(xì)胞在體內(nèi)外均表現(xiàn)出持續(xù)和持久的抑瘤作用，其抑瘤效果與靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞相當(dāng)，但無GVHD等并發(fā)癥。更重要的是，當(dāng)與Isatuximab（抗CD38單克隆抗體）相結(jié)合時(shí)，iDuo-MM-CAR-NK細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了ADCC活性的最大化，對(duì)MM的抗腫瘤作用也效果顯著。
最近，Century Therapeutics公司開發(fā)了一款CAR-iNK細(xì)胞產(chǎn)品，通過六次基因修飾，旨在提高持久性、功能性和安全性。使用這種CAR-iNK細(xì)胞療法治療復(fù)發(fā)或難治性分化型CD19陽性B細(xì)胞惡性腫瘤的I期臨床試驗(yàn)正在招募中，以評(píng)估其安全性、藥代動(dòng)力學(xué)和初步療效。
CAR-iNK細(xì)胞療法在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)
在符合cGMP的條件下生產(chǎn)iPSC是滿足臨床規(guī)范的必要條件。首先獲得用于衍生iPSC的體細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)傳染病病原體或疾病測(cè)試（RCDAs），其次CAR-iNK細(xì)胞必須通過穩(wěn)健、可重復(fù)和符合cGMP的制造工藝產(chǎn)生。
提高CAR-iNK細(xì)胞在實(shí)體瘤中抗腫瘤活性的策略
近年來，許多臨床前和臨床研究已經(jīng)證明了CAR-iNK細(xì)胞用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的可行性和有效性。然而，CAR修飾的免疫細(xì)胞在實(shí)體瘤中的療效受到腫瘤抗原異質(zhì)性、腫瘤浸潤(rùn)受限和免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）的阻礙。在過去的幾年里，已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來改善CAR-T/NK細(xì)胞的擴(kuò)增、持久性、對(duì)TME的抗性和代謝適應(yīng)性，這些方法也可用于CAR-iNK細(xì)胞治療。
改善CAR-iNT細(xì)胞的擴(kuò)增和持久性
IL-15作為NK細(xì)胞增殖和維持的重要細(xì)胞因子，已被廣泛應(yīng)用于提高CAR-iNK細(xì)胞的持久性和細(xì)胞毒性。除IL-15以外，IL-12和IL-18細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣【ML】NK細(xì)胞在體內(nèi)也會(huì)表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤活性和改善的作用。另外對(duì)于NK細(xì)胞的增殖和成熟，IL-21也同樣功不可沒。研究人員還發(fā)現(xiàn)，在iPSC中敲除HLA-I和II可以逃避異基因T和NK細(xì)胞的識(shí)別，從而促進(jìn)基于iPSC的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的持續(xù)性。
▲ 增強(qiáng)CAR-iNK細(xì)胞活性的策略
增強(qiáng)CAR-iNK細(xì)胞在實(shí)體瘤中的浸潤(rùn)作用
實(shí)體瘤中CAR-iNK細(xì)胞的浸潤(rùn)不足是限制治療效果的重要因素。研究人員參考CAR-T細(xì)胞分泌乙酰肝素酶等基質(zhì)降解酶，促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)和抗腫瘤活性這一策略，用于CAR-iNK細(xì)胞治療以增強(qiáng)其向不同實(shí)體瘤的輸送。
增加CAR-iNK細(xì)胞的腫瘤靶點(diǎn)以克服腫瘤異質(zhì)性
抗原丟失和腫瘤異質(zhì)性是導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)的重要因素，將多種抗原靶向癌癥細(xì)胞是預(yù)防CAR的細(xì)胞治療后抗原丟失的方法之一。除了用靶向不同抗原的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合治療外，許多機(jī)構(gòu)已經(jīng)開發(fā)出了雙特異性CAR。例如國(guó)外開發(fā)的由合成Notch（synNotch）受體介導(dǎo)的多抗原啟動(dòng)和殺傷識(shí)別通路，通過靶向同質(zhì)但非絕對(duì)腫瘤特異件的抗原，實(shí)現(xiàn)了完整可控的腫瘤細(xì)胞殺傷。這些技術(shù)可能為CAR-iNK細(xì)胞成功靶向異質(zhì)性腫瘤提供類似的方案，同時(shí)最大限度地減少腫瘤內(nèi)外的毒性。
基因工程CAR-iNK細(xì)胞克服免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）
CAR-iNK細(xì)胞必須面臨不利的代謝條件包括缺氧、酸性pH和低血糖水平，以及可能損害NK細(xì)胞功能的免疫抑制細(xì)胞。作為最重要的免疫抑制細(xì)胞因子之一的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)子β（TGF-β）缺氧狀態(tài)下通常會(huì)以多種方式損害NK細(xì)胞的功能。帶有TGF-β抗體或抑制劑的CAR-iNK細(xì)胞有望改善NK細(xì)胞對(duì)免疫抑制TME的抗性。除TGF-β以外，腺苷是另一種關(guān)鍵的免疫抑制代謝產(chǎn)物，限制了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的激活同時(shí)還會(huì)損害抗腫瘤免疫反應(yīng)。消融腺苷信號(hào)傳導(dǎo)或給予A2A腺苷受體(A2AR)拮抗劑可以增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。因此，阻斷或切換CAR-iNK細(xì)胞中的這些免疫抑制信號(hào)通路有助于克服免疫抑制性TME。
調(diào)節(jié)CAR-iNK細(xì)胞的代謝適應(yīng)度并防止其耗竭
細(xì)胞代謝在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究人員通過激活mTOR信號(hào)通路來改善的代謝適應(yīng)度，從而增強(qiáng)iPSC-NK細(xì)胞的擴(kuò)增和抗腫瘤功能。此外抑制性受體上調(diào)也有助于NK細(xì)胞的免疫耐受，但這些改善CAR-iNK細(xì)胞功能的策略需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
CAR-iNK細(xì)胞療法在聯(lián)合治療中的應(yīng)用
CAR-iNK細(xì)胞可以與TKIs、放療和單克降抗體聯(lián)合使用，以進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤作用。
總結(jié)
CAR介導(dǎo)的免疫治療在血液惡性腫瘤和一些實(shí)體腫瘤中的成功推動(dòng)了用于癌癥免疫治療的CAR-iNK細(xì)胞的發(fā)展。iPSC的優(yōu)勢(shì)為增強(qiáng)CAR修飾的iPSC衍生的NK細(xì)胞的功能提供了許多機(jī)會(huì)，使其成為對(duì)抗血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的一把利刃。此外iPSC來源較廣，在體外重新編程的增殖潛力十分可觀，顯著降低了生產(chǎn)成本，使CAR-iNK細(xì)胞更有益于臨床應(yīng)用。
參考資料：https://www.biospace.com