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2024年9月11日，上海市東方醫(yī)院(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院)干細(xì)胞基地再生醫(yī)學(xué)研究所、同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院何志穎教授、張文成副研究員團(tuán)隊(duì)與美國(guó)北卡羅來納大學(xué)教堂山分校(UNC-CH)Lola Reid教授團(tuán)隊(duì)在BioactiveMaterials上發(fā)表了題為“Hormonally andChemically Defined Expansion Conditions for Organoids of Biliary Tree StemCells”的研究論文。
研究團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了一個(gè)精確定義的BTSC(膽道干細(xì)胞)類器官擴(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過深入分析確定了BTSC類器官在體外擴(kuò)增所需的關(guān)鍵微環(huán)境因素，并據(jù)此開發(fā)了一種名為BEX(Biliary tree stem cell expansion hydrogel system)的水凝膠擴(kuò)增系統(tǒng)。該系統(tǒng)使得BTSC及其衍生的類器官數(shù)量得以千倍增長(zhǎng)。這些擴(kuò)增后的BTSC及其類器官不僅能夠在體外分化成具有功能的肝細(xì)胞，而且在體內(nèi)，通過研究團(tuán)隊(duì)先前開發(fā)的干細(xì)胞補(bǔ)片移植技術(shù)，能夠有效治療肝衰竭模型小鼠。這一系統(tǒng)的建立為BTSC在臨床治療中的應(yīng)用提供了大量且功能完備的干細(xì)胞資源。
01 人膽管樹干細(xì)胞
人膽管樹干細(xì)胞(biliary tree stem cells,BTSC)是位于肝內(nèi)、外和胰外膽管樹壁內(nèi)膽管周腺(peribiliary tree glands,PBG)內(nèi)干細(xì)胞龕中的肝/胰腺共祖干細(xì)胞。
在器官的發(fā)育和再生過程中，BTSC具有分化成多種干細(xì)胞亞群的能力。一方面，它們能夠分化為位于赫林管內(nèi)或附近的肝干細(xì)胞(hepatic stem cells, HpSC)及其后代肝母細(xì)胞(hepatoblast, HBs)，從而參與肝臟的再生過程。另一方面，BTSC也能通過分化為位于肝/胰腺總導(dǎo)管的PBG中的胰腺干細(xì)胞，進(jìn)而參與胰腺的再生。這些特性使得BTSC在臨床應(yīng)用中具有重要的潛力，為肝臟和胰腺功能損傷的修復(fù)提供了新的治療策略。
02 研究步驟
該研究成功建立了BEX體系，實(shí)現(xiàn)了BTSC及其類器官的體外大量擴(kuò)增。
研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)比BTSC與成熟肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，精確識(shí)別了維持BTSC干性的關(guān)鍵信號(hào)通路，包括Hippo、PI3K/AKT、MAPK和Ras等。
結(jié)合之前對(duì)胚胎干細(xì)胞(ESC)和胃上皮細(xì)胞來源的內(nèi)胚層干細(xì)胞的研究，研究者們篩選出一系列小分子化合物，如0.5μM Bix01294、2μM Bay K8644、0.04μM RG108、2μM SB431542、10μM毛喉素和1μM A83-01等，以及生長(zhǎng)因子或旁分泌信號(hào)如50 ng/mL EGF、100 ng/mL R-Spondin1(RSPO1)、100 ng/mL Noggin和50 ng/mL Wnt3a等，共同構(gòu)成了10因子-確定增殖培養(yǎng)基(10-Defined-Proliferative-Medium, 10-DPM)。這一培養(yǎng)基成功實(shí)現(xiàn)了原代BTSC的擴(kuò)增，7天內(nèi)擴(kuò)增達(dá)20倍。進(jìn)一步研究表明，10-DPM不僅能有效維持BTSC的傳代擴(kuò)增，而且在結(jié)合水凝膠(如Matrigel或透明質(zhì)酸-肝素水凝膠)的三維擴(kuò)增體系下，能夠獲得BTSC類器官，并實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期擴(kuò)增傳代。
RG 108、A8301、Forskolin、BAY 8644對(duì)于mBTSC的擴(kuò)張至關(guān)重要
在對(duì)10-DPM進(jìn)行組合優(yōu)化篩選的研究中，結(jié)果證實(shí)了在所有小分子化合物中，DNA甲基化酶抑制劑RG108、TGFβ信號(hào)通路抑制劑A83-01、cAMP激動(dòng)劑毛喉素、以及鈣離子通道激動(dòng)劑Bay K8644組成的4-DPM是原代BTSC擴(kuò)增的必要組分。然而，缺少Wnt信號(hào)通路的激活配體RSPO1時(shí)，BTSC的傳代和類器官形成以及持續(xù)傳代的能力會(huì)明顯受到影響。補(bǔ)充RSPO1后構(gòu)成的5-DPM，在促進(jìn)原代BTSC增殖、BTSC二維擴(kuò)增以及BTSC類器官形成和長(zhǎng)期擴(kuò)增維持方面的能力與10-DPM相當(dāng)，從而證實(shí)了Wnt信號(hào)通路在BTSC擴(kuò)增和BTSC類器官形成中的關(guān)鍵作用。
基于水凝膠的三維擴(kuò)增體系相較于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)條件，展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。在5-DPM作為擴(kuò)增培養(yǎng)基的條件下，水凝膠預(yù)處理的二維體系僅能在有限的代次內(nèi)維持BTSCs的屬性。相對(duì)而言，BTSC類器官在5-DPM條件下能夠穩(wěn)定傳代超過20代，并在60天內(nèi)實(shí)現(xiàn)超過3000倍的細(xì)胞擴(kuò)增。此外，通過對(duì)比二維和三維條件下擴(kuò)增的BTSCs的轉(zhuǎn)錄組圖譜分析，發(fā)現(xiàn)三維擴(kuò)增體系能顯著減少細(xì)胞增殖過程中產(chǎn)生的DNA損傷，為細(xì)胞提供了二維單層培養(yǎng)所缺乏的損傷保護(hù)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了三維培養(yǎng)體系在維持BTSCs擴(kuò)增和功能方面的重要性。
在確認(rèn)了培養(yǎng)基后，研究進(jìn)一步對(duì)水凝膠的成分進(jìn)行了優(yōu)化。與其他三維培養(yǎng)擴(kuò)增研究相似，研究中首先借鑒了Hans Clevers等團(tuán)隊(duì)基于Matrigel的類器官形成和維持體系。Matrigel(康寧)主要由四種主要的基底膜成分組成，包括層粘連蛋白(約60%)、IV型膠原(約30%)、巢蛋白(約8%)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)，尤其是串珠蛋白(約2~3%)。其他組分的生物學(xué)活性已經(jīng)有大量研究，但其獨(dú)立于蛋白多糖的糖胺聚糖尚未確定。通過結(jié)合BTSC體內(nèi)微環(huán)境中的糖胺聚糖組分，并在透明質(zhì)酸水凝膠中添加硫酸乙酰肝素及其蛋白多糖組分(HAHS)，成功地實(shí)現(xiàn)對(duì)Matrigel的替代。并最終與5-DPM結(jié)合，形成成分確定的BTSC類器官體外擴(kuò)增的BEX體系。
與單層(2D)培養(yǎng)相比，作為類器官(3D)維持更好地提高了mBTSC對(duì)DNA損傷的抵抗力
該研究成功建立了BEX體系，實(shí)現(xiàn)了BTSC及其類器官的體外大量擴(kuò)增。擴(kuò)增后的BTSC不僅保持了肝向分化的潛能，而且在動(dòng)物模型中展現(xiàn)出了救治肝衰竭的能力。這項(xiàng)工作為基于BTSC移植治療肝衰竭的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了一個(gè)穩(wěn)定且高效的種子細(xì)胞制備體系，解決了BTSC獲取和擴(kuò)增的關(guān)鍵問題，為臨床治療提供了有力支持。