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來源：干細(xì)胞與外泌體
iPS 細(xì)胞在干細(xì)胞治療中的優(yōu)勢在于可以使用自體 iPS 細(xì)胞，從而避免同種異體免疫排斥。然而，iPS 細(xì)胞系的建立極其耗時(shí)且成本高昂，尤其是建立受良好生產(chǎn)規(guī)范 (GMP) 確保的臨床級(jí) iPS 細(xì)胞系。
此外，成功獲得 iPS 細(xì)胞系會(huì)受到供體個(gè)體差異（包括年齡）的影響。因此，實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)研究中心網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃轉(zhuǎn)向使用來自定制自體 iPS 細(xì)胞的同種異體 iPS 細(xì)胞系。
日本iPS 細(xì)胞庫存項(xiàng)目旨在從人類白細(xì)胞抗原 (HLA) 單倍型純合的人中產(chǎn)生一系列 iPS 細(xì)胞系。就HLA-A、HLA-B和HLA-DR而言，這些純合細(xì)胞的相容性比雜合細(xì)胞更廣泛，140個(gè)同源單倍型系將覆蓋90%的日本人口。
iPS細(xì)胞臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀和未來方向
日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院、明治大學(xué)國際生物資源研究所的研究員Hiraku Tsujimoto和Kenji Osafune在行業(yè)期刊The FEBS Journal上發(fā)表了題為Current status and future directions of clinical applications using iPS cells—focus on Japan（iPS細(xì)胞臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀和未來方向——以日本為重點(diǎn)）的行業(yè)研究報(bào)告。
該報(bào)告總結(jié)了近年來，使用 iPS 細(xì)胞技術(shù)的再生醫(yī)學(xué)取得了顯著進(jìn)展包括這些技術(shù)及其臨床應(yīng)用；討論了 iPS 細(xì)胞建立的進(jìn)展，包括日本的 HLA-homo iPS 細(xì)胞儲(chǔ)備項(xiàng)目以及利用基因組編輯技術(shù)開發(fā)低抗原 iPS 細(xì)胞的進(jìn)展；描述了正在或接近臨床應(yīng)用的基于 iPS 細(xì)胞的療法，包括眼科、神經(jīng)病學(xué)、心臟、血液學(xué)、軟骨和代謝疾病的治療等。報(bào)告主要內(nèi)容如下：
iPS 細(xì)胞徹底改變醫(yī)學(xué)的新技術(shù)
通過發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干 (iPS) 細(xì)胞，Yamanaka 及其同事克服了與使用胚胎干 (ES) 細(xì)胞相關(guān)的破壞人類囊胚的主要倫理問題。研究發(fā)現(xiàn)，OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC (OSKM) 四種因子的組合足以將小鼠和人類體細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞。
由于 iPS 細(xì)胞具有在體外無限擴(kuò)展并分化為體內(nèi)任何細(xì)胞類型的潛力，因此可用于生成多種分化細(xì)胞，用于細(xì)胞治療、疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)篩選。
對(duì)于細(xì)胞治療來說，由于該技術(shù)最初使用基因組整合病毒作為載體，因此存在病毒整合到癌癥相關(guān)基因附近位置的染色體中，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。然而，此后已經(jīng)開發(fā)出安全的方法，例如使用無法整合到染色體中的游離質(zhì)粒，加速iPS細(xì)胞走向臨床應(yīng)用。
由于基因組編輯技術(shù)的最新進(jìn)展，現(xiàn)在可以快速準(zhǔn)確地生成具有導(dǎo)致疾病的遺傳傾向的疾病特異性 iPS 細(xì)胞。隨后針對(duì)許多疑難病癥進(jìn)行了疾病建模研究，其中疾病特異性 iPS 細(xì)胞分化為受損的細(xì)胞類型或組織，以在體外重現(xiàn)疾病表型。
iPS 細(xì)胞是徹底改變醫(yī)學(xué)的新技術(shù)?；趇PS細(xì)胞技術(shù)的臨床試驗(yàn)正在美國、中國、德國和其他國家進(jìn)行（例如，NCT03763136、NCT03759405、NCT04396899、NCT04106167、NCT03841110和NCT04245722），日本進(jìn)行的臨床試驗(yàn)比其他任何地方都多。因此，研究人員將重點(diǎn)關(guān)注日本的臨床研究。
安全臨床應(yīng)用技術(shù)
iPS細(xì)胞的建立
建立iPS細(xì)胞的方法可根據(jù)重編程方法大致分類，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、仙臺(tái)病毒 、腺病毒、質(zhì)粒、附加型質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、小環(huán) DNA 、RNA 、蛋白質(zhì)和小-分子化合物。還可以根據(jù)效率和安全性進(jìn)一步分類；即重編程的效率、技術(shù)難度以及整合到基因組中的風(fēng)險(xiǎn)。通常，效率和安全性呈負(fù)相關(guān)。因此，優(yōu)選的重編程方法將取決于研究目的。由于安全問題較少，高效的方法是基礎(chǔ)研究的首選。另一方面，在臨床應(yīng)用中，安全性至關(guān)重要。
iPS細(xì)胞維持培養(yǎng)基的開發(fā)
傳統(tǒng)上，人類多能干細(xì)胞（iPS/ES 細(xì)胞）的培養(yǎng)是在補(bǔ)充有血清替代品和成纖維細(xì)胞生長因子 2 (FGF2) 的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，使用小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞。作為 iPS 細(xì)胞臨床應(yīng)用的第一步，使用專用培養(yǎng)基和不含飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)開發(fā)了許多無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法。京都大學(xué) iPS 細(xì)胞研究與應(yīng)用中心 (CiRA) 開發(fā)了“StemFit”，這是一種不含動(dòng)物源成分的 iPS/ES 細(xì)胞培養(yǎng)基 。
iPS 細(xì)胞庫存項(xiàng)目
京都大學(xué) CiRA 基金會(huì)的 iPS 細(xì)胞庫存項(xiàng)目正在為再生醫(yī)學(xué)而開發(fā)，并使用健康捐獻(xiàn)者的血液樣本，這些捐獻(xiàn)者的人類白細(xì)胞抗原（人類白細(xì)胞抗原；HLA-A、HLA-B 和 HLA-A、HLA-B 和HLA-DRB1)，這使得移植不太可能引起免疫排斥。
在自體移植的情況下，iPS 細(xì)胞是從患者的血液或其他體細(xì)胞中產(chǎn)生的，并檢查質(zhì)量。接下來，iPS 細(xì)胞分化為用于患者治療的細(xì)胞并進(jìn)行移植。盡管iPS細(xì)胞庫存項(xiàng)目中使用的iPS細(xì)胞系是同種異體的，但與自體移植相比，它們節(jié)省了時(shí)間和成本。
圖：iPS 細(xì)胞庫存項(xiàng)目示意圖。HLA 純合捐獻(xiàn)者捐獻(xiàn)外周血，從中產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞的細(xì)胞庫。
在該項(xiàng)目中，CiRA 基金會(huì)在其準(zhǔn)備設(shè)施中生成 iPS 細(xì)胞。此后，它僅存儲(chǔ)已被確認(rèn)安全的有質(zhì)量保證的iPS細(xì)胞，并將其提供給日本和國外的醫(yī)療和研究機(jī)構(gòu)，用于包括臨床應(yīng)用在內(nèi)的醫(yī)學(xué)研究目的。
截至 2021 年 3 月，來自 7 個(gè) HLA 純合 (HLA-homo) 供體的 iPS 細(xì)胞可供使用，估計(jì)覆蓋了約 40% 的日本人口。然而，HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRB1 純合 iPS 細(xì)胞供體非常罕見。因此，要收集覆蓋日本人口約90%的140種，需要大量的時(shí)間和成本。事實(shí)上，據(jù)估計(jì)，必須檢查多達(dá) 16 000 人的人類白細(xì)胞抗原類型才能找到 140 種類型。
使用 iPS 細(xì)胞的細(xì)胞療法
年齡相關(guān)性黃斑變性和色素性視網(wǎng)膜炎
年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）是一種影響視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的進(jìn)行性疾病，導(dǎo)致中央視力逐漸受損。晚期AMD會(huì)導(dǎo)致中央視力喪失，導(dǎo)致嚴(yán)重且永久性的視力障礙，這對(duì)生活質(zhì)量和功能獨(dú)立性產(chǎn)生重大影響。如果早期發(fā)現(xiàn)疾病，可以通過抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）治療在一定程度上阻止病情進(jìn)展，并將損害降至最低；然而，AMD 仍然是全球嚴(yán)重不可逆視力喪失的第三大原因。
圖：日本正在進(jìn)行基于 iPS/ES 細(xì)胞的細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)。方框中的名稱表示疾病，方框下方的名稱表示移植的 iPS 細(xì)胞產(chǎn)品的類型。
表 1. 目前在日本正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。AMD，年齡相關(guān)性黃斑變性；ALS，肌萎縮側(cè)索硬化癥；AD，阿爾茨海默??；FOP，進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良。
角膜緣干細(xì)胞缺乏
角鞏膜緣上皮干細(xì)胞的正常功能是角膜上皮維持和再生的前提。一般認(rèn)為，這些上皮干細(xì)胞存在于角膜緣的基底上皮中，是透明角膜和不透明鞏膜之間的過渡區(qū)。因此，這些細(xì)胞被稱為角膜緣上皮干細(xì)胞（LSC）。
正常的角膜緣和LSC充當(dāng)屏障，防止結(jié)膜上皮侵入角膜表面。LSC 維持角膜上皮的正常穩(wěn)態(tài)和傷口愈合。
當(dāng)結(jié)膜上皮侵入角膜，角膜表面被包括血管在內(nèi)的結(jié)膜組織覆蓋時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的角膜混濁，導(dǎo)致視力障礙甚至失明。LSC 缺陷可能是由遺傳缺陷或?qū)?LSC 及其生態(tài)位的繼發(fā)性損傷引起的，這可能導(dǎo)致角膜上皮傷口愈合異常和/或角膜表面結(jié)膜化。原因包括燒傷、堿性或酸性腐蝕、史蒂文斯-約翰遜綜合征和眼部類天皰瘡。供體角膜移植已被用于治療可導(dǎo)致失明的嚴(yán)重角膜上皮疾病，但存在排斥反應(yīng)和供體短缺的問題。
帕金森病
當(dāng)中腦黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元因某種原因受損，產(chǎn)生的多巴胺量減少時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)帕金森病。帕金森病是僅次于阿爾茨海默病 (AD) 的第二常見神經(jīng)退行性疾病，在美國 40 歲男性和女性的剩余終生風(fēng)險(xiǎn)分別為 2% 和 1.3%。
日本Jun Takahashi 團(tuán)隊(duì)于 2018 年 8 月啟動(dòng)了一項(xiàng)使用 iPS 細(xì)胞衍生的多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞治療帕金森病的臨床試驗(yàn) (UMIN000033564)。用于移植的細(xì)胞從 HLA-homo iPS 細(xì)胞儲(chǔ)備中分化出來，并通過 FACS 分選 CORIN 進(jìn)行純化，他們證明 CORIN 是一種細(xì)胞表面標(biāo)記，對(duì)多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞具有特異性。
在臨床試驗(yàn)之前，他們證實(shí)了移植的人類iPS細(xì)胞來源的多巴胺神經(jīng)祖細(xì)胞在帕金森病食蟹猴模型中的有效性和安全性。移植的猴子表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)和帕金森病癥狀改善。正電子發(fā)射斷層掃描分析顯示，移植的細(xì)胞在大腦中合成了多巴胺。此外，兩年隨訪后沒有觀察到腫瘤形成，腦切片的組織學(xué)分析也沒有發(fā)現(xiàn)任何惡變的證據(jù)。
脊髓損傷
脊髓損傷是由于受傷或事故導(dǎo)致脊髓受損，導(dǎo)致大腦無法向移動(dòng)身體的神經(jīng)傳遞指令，導(dǎo)致四肢癱瘓。2016年的一項(xiàng)全球調(diào)查顯示，脊髓損傷的患病人數(shù)超過2000萬例。僅在那一年，全球就新增病例約 100 萬例，日本新增病例超過 36,000 例。在許多情況下，患者只能坐在輪椅上。目前，沒有任何治療方法可以完全修復(fù)受損區(qū)域。
2019 年，Hideyuki Okano 團(tuán)隊(duì)啟動(dòng)了一項(xiàng)臨床研究，將源自 HLA-homo iPS 細(xì)胞儲(chǔ)備的神經(jīng)祖細(xì)胞移植到亞急性（受傷后 1-2 周）脊髓損傷患者中。主要目標(biāo)是確認(rèn)移植細(xì)胞的安全性和有效性。生成并冷凍保存神經(jīng)祖細(xì)胞。將冷凍的神經(jīng)祖細(xì)胞解凍以進(jìn)行最終準(zhǔn)備，并直接注射到脊髓損傷區(qū)域（UMIN000035074）。這種移植有望使受傷的神經(jīng)再生并恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能和感覺。移植后患者的隨訪時(shí)間約為一年。由于沒有進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原匹配，因此在移植后的前六個(gè)月內(nèi)給予免疫抑制藥物。患者也參與康復(fù)治療。
心臟衰竭
缺血性心臟病是心力衰竭的主要病因，其發(fā)病機(jī)制是由于冠狀動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致心肌組織慢性缺血，導(dǎo)致功能性心肌細(xì)胞壞死。由于成熟的心肌細(xì)胞無法自我更新，缺血和壞死區(qū)域被纖維組織取代。結(jié)果，局部室壁運(yùn)動(dòng)受損，心肌收縮力下降。為了補(bǔ)償這種減少，心臟擴(kuò)張，對(duì)未直接受到缺血影響的心肌造成壓力損傷，導(dǎo)致進(jìn)一步纖維化。這種現(xiàn)象稱為重塑，并進(jìn)一步惡化心臟功能。
因此，補(bǔ)充功能性心肌細(xì)胞是減少心力衰竭進(jìn)展的非常明智的方法。由于心肌細(xì)胞不具有增殖能力，很難一次性大量生成，因此在最初的再生研究中使用了與心肌細(xì)胞相似的細(xì)胞。具體來說，骨骼肌細(xì)胞、骨髓來源的單核細(xì)胞和間充質(zhì)干/基質(zhì)細(xì)胞（MSC）被認(rèn)為是候選細(xì)胞，并進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。由于骨骼肌細(xì)胞不是心肌細(xì)胞，因此它們有望通過與宿主的心肌融合來支持收縮力，但它們也會(huì)誘發(fā)心律失常。間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的效果甚至更差。
血小板減少癥
日本每年消耗來自超過 170 萬升獻(xiàn)血的血小板制劑。血小板制劑在采血后只能保存四天。此外，由于少子化和人口老齡化，獻(xiàn)血人數(shù)正在減少，但需要醫(yī)療護(hù)理的老年人數(shù)量卻在增加。因此，未來不僅是血小板制劑，輸血制劑也可能出現(xiàn)短缺。
如果由于再生障礙性貧血或其他疾病導(dǎo)致嚴(yán)重血小板減少，則需要進(jìn)行血小板輸注。然而，可能會(huì)出現(xiàn)血小板輸注無效，即輸注后血液中的血小板計(jì)數(shù)不上升。其原因包括輸注的血小板被識(shí)別為外來物并被患者自身的免疫細(xì)胞破壞。在這種情況下，血小板不能通過同種異體血小板輸注來補(bǔ)充。然而，如果血小板是由患者自身的細(xì)胞制成的，輸血應(yīng)該可以防止免疫反應(yīng)。
Koji Eto小組已成功利用生物反應(yīng)器裝置從iPS細(xì)胞產(chǎn)生大量血小板，并正在對(duì)患有血小板輸注無效的再生障礙性貧血患者進(jìn)行自體輸注iPS細(xì)胞衍生血小板的臨床研究（jRCTa050190117）。該患者試驗(yàn)的目的是測試所施用的血小板產(chǎn)品的安全性。該研究設(shè)計(jì)是一項(xiàng)單中心、開放標(biāo)簽、非對(duì)照研究/單劑量遞增研究，輸血后隨訪一年。血小板輸注過程首先從患者身上采集細(xì)胞并生成 iPS 細(xì)胞。然后，從 iPS 細(xì)胞中產(chǎn)生巨核細(xì)胞并冷凍作為主細(xì)胞庫。將這些主細(xì)胞解凍，巨核細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長后，進(jìn)行血小板生產(chǎn)。血小板分離、濃縮、洗滌后，通過照射消滅殘留的巨核細(xì)胞，然后輸給患者。主要終點(diǎn)是安全性，次要終點(diǎn)是療效（血小板增加）。
癌癥免疫療法
近年來，癌癥免疫療法作為繼手術(shù)治療、化療（抗癌藥物和激素施用）和放射治療之后的治療選擇而受到關(guān)注。CD1d 限制性不變自然殺傷 T (iNKT) 細(xì)胞是表達(dá)單一 T 細(xì)胞受體（人類中的 Vα24-Jα18 和 Vβ11 鏈，小鼠中的 Vα14-Jα18 和 Vβ8.2 鏈）的淋巴細(xì)胞，并通過識(shí)別所呈現(xiàn)的糖脂抗原來激活CD1d，一種 MHC I 類分子。
活化的iNKT細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞毒性分子（如穿孔素）表現(xiàn)出直接的細(xì)胞毒活性，同時(shí)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子（如IFNγ），誘導(dǎo)NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞活化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。作為頭頸癌的新療法，Haruhiko Koseki 和 Shin-Ichiro Fujii 小組正在使用 iPS 細(xì)胞衍生的 NKT 細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗(yàn)(jRCT2033200116)。
關(guān)節(jié)軟骨損傷
骨關(guān)節(jié)炎是全世界最常見的關(guān)節(jié)疾病，影響 60 歲以上的大約 10% 的男性和 18% 的女性。關(guān)節(jié)軟骨具有獨(dú)特而光滑的結(jié)構(gòu)，使我們能夠順利、無痛地移動(dòng)關(guān)節(jié)。受損的關(guān)節(jié)軟骨會(huì)在移動(dòng)關(guān)節(jié)時(shí)引起疼痛。
Noriyuki Tsumaki 小組已開始一項(xiàng)通過 HLA-homo iPS 細(xì)胞來源的軟骨移植來再生關(guān)節(jié)軟骨損傷的臨床試驗(yàn) (jRCTa050190104)。在這項(xiàng)臨床研究中，僅對(duì)一個(gè)膝蓋進(jìn)行移植，并納入了四名符合標(biāo)準(zhǔn)的患者（年齡在20至70歲之間，軟骨損傷范圍有限）。手術(shù)使用關(guān)節(jié)鏡移植軟骨組織。手術(shù)后患者將康復(fù)6周，軟骨再生和修復(fù)情況將隨訪1年。該小組已成功利用人類 iPS 細(xì)胞產(chǎn)生高質(zhì)量的軟骨。
先前的動(dòng)物研究證實(shí)，iPS細(xì)胞衍生的軟骨不會(huì)產(chǎn)生腫瘤，并且可以在移植區(qū)域再生軟骨。該臨床研究的目的是評(píng)估軟骨損傷患者將軟骨植入膝關(guān)節(jié)受損區(qū)域的安全性。主要終點(diǎn)是不良事件的頻率和腫瘤發(fā)生的存在。為了制備軟骨，從 HLA-同源 iPS 細(xì)胞儲(chǔ)備中誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞，并從軟骨細(xì)胞產(chǎn)生軟骨組織。研究人員的目標(biāo)是在未來用這種療法治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。
總之，使用 iPS 細(xì)胞的臨床醫(yī)學(xué)已安全有效地取得進(jìn)展。在這篇報(bào)告中，研究人員對(duì)日本使用 iPS 細(xì)胞的臨床試驗(yàn)進(jìn)行了分析和總結(jié)，并解釋了基因編輯的低抗原 iPS 細(xì)胞如何有潛力解決細(xì)胞療法中的許多免疫學(xué)問題。此外，這些 iPS 細(xì)胞可以作為單批次細(xì)胞產(chǎn)品的來源，用于治療患者體內(nèi)更廣泛分布的人類白細(xì)胞抗原類型，從而降低每劑治療的成本。隨著逃避免疫的風(fēng)險(xiǎn)增加，細(xì)胞致瘤性研究也需要在各種細(xì)胞和應(yīng)用上進(jìn)行驗(yàn)證。
隨著低抗原 iPS 細(xì)胞系和個(gè)體患者 iPS 細(xì)胞系的建立，細(xì)胞療法有望擴(kuò)展到多種疾病。此外，開發(fā)從 iPS 細(xì)胞產(chǎn)生功能成熟的細(xì)胞或組織以及人體大小器官的方法將有助于新型再生療法和更合適的疾病模型。未來幾年，基于 iPS 細(xì)胞技術(shù)的再生醫(yī)學(xué)將得到進(jìn)一步普及。