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大規(guī)模生產(chǎn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 對(duì)于治療多種臨床適應(yīng)癥至關(guān)重要。然而，培養(yǎng)足夠的iPSC用于臨床應(yīng)用存在不小的挑戰(zhàn)，包括它們敏感的多能狀態(tài)以及對(duì)支持基質(zhì)的依賴。開發(fā)可放大且滿足臨床需求的干細(xì)胞生物工藝策略需要結(jié)合能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分化狀態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和活性的內(nèi)在標(biāo)志物的方法。此外，適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)模式，從而以懸浮狀態(tài)支持高質(zhì)量的懸浮干細(xì)胞生長(zhǎng)是工業(yè)化規(guī)模的關(guān)鍵。在本文中，我們將介紹細(xì)胞培養(yǎng)基、懸浮模式和監(jiān)測(cè)技術(shù)的概況，這些技術(shù)可以在誘導(dǎo)、擴(kuò)增和生產(chǎn)過程中保持iPSC的質(zhì)量和多能性。
干細(xì)胞生產(chǎn)的最新進(jìn)展以及挑戰(zhàn)
涉及干細(xì)胞的細(xì)胞療法 (如組織移植或藥物發(fā)現(xiàn)) 被用于治療各種臨床適應(yīng)癥，主要用于腫瘤、心臟病、免疫和神經(jīng)疾病領(lǐng)域。因此，干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)主要焦點(diǎn)是在保持細(xì)胞分化控制的同時(shí)，推進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)策略。傳統(tǒng)上，胚胎干細(xì)胞 (ESC) 是細(xì)胞治療的理想細(xì)胞類型，因?yàn)槠涔逃械亩嗄苄?，即?xì)胞分化成任何特化細(xì)胞類型的能力。這些細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為再生醫(yī)學(xué)和各種病理疾病的治療提供了巨大的機(jī)會(huì)。無(wú)論干細(xì)胞來源如何，ESC在增殖過程中必須經(jīng)歷自我更新，以維持多能性，在此過程中，向特定細(xì)胞類型的分化受到抑制。
2007年，Yamanaka及其同事領(lǐng)導(dǎo)了干細(xì)胞領(lǐng)域的重大技術(shù)突破，成功地將人類體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為與人類ESC (hESC) 具有相似基因表達(dá)譜和多能性的干細(xì)胞。這些細(xì)胞被稱為人類iPSC (hiPSC)。通過避免使用胚胎提取干細(xì)胞來解決倫理問題，iPSC是一個(gè)更有利的研究和臨床應(yīng)用平臺(tái)。鑒于其固有的自我更新能力、多能性和相對(duì)較低的免疫原性，iPSC代表了一種極有前景的、無(wú)限的患者來源細(xì)胞，用于人類遺傳疾病建模和毒理研究，這降低了藥物開發(fā)和臨床試驗(yàn)的總體成本和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。由于其多方面的能力，iPSC技術(shù)仍然是個(gè)性化細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)有前途的科學(xué)工具。
目前的臨床細(xì)胞治療和人類組織再生需要10^8-10^10的臨床級(jí)干細(xì)胞，并遵循現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范 (cGMP)工藝培養(yǎng)。然而，由于依賴于支持基質(zhì)以及多能干細(xì)胞敏感的多能狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)放大到必要的程度仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。收獲過程中iPSC的最終質(zhì)量取決于細(xì)胞的代謝狀態(tài)；更具體地說，維持多能狀態(tài)和自我更新對(duì)于生產(chǎn)臨床級(jí)iPSC至關(guān)重要。因此，監(jiān)測(cè)細(xì)胞分化狀態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和活性的內(nèi)在標(biāo)記的方法對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)最有用。此外，現(xiàn)有平臺(tái)正在進(jìn)行優(yōu)化，以滿足cGMP標(biāo)準(zhǔn)，以便有效地將生物工藝放大到臨床生產(chǎn)環(huán)境。在本文中，我們將強(qiáng)調(diào)iPSC細(xì)胞培養(yǎng)方法的最新進(jìn)展，包括培養(yǎng)基、懸浮模式和監(jiān)測(cè)技術(shù)，這些方法在一定程度上保持了iPSC的質(zhì)量和多能性，以滿足臨床生產(chǎn)的需要。此外，我們將還討論未來有可能提高iPSC生物工藝效率和產(chǎn)量的技術(shù)。
從異質(zhì)細(xì)胞群中分離iPSC
很多信號(hào)可以激活干細(xì)胞分化，因此，細(xì)胞培養(yǎng)條件的細(xì)微變化或?qū)?xì)胞的應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞群的異質(zhì)性分化。這是一個(gè)嚴(yán)重的安全問題，因?yàn)榉只?xì)胞污染可能在細(xì)胞移植受體中引起潛在的腫瘤或畸胎瘤形成。然而，自發(fā)的干細(xì)胞分化可以在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生，如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在細(xì)胞外基質(zhì)中延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)所觀察到的。調(diào)節(jié)這種類型的反應(yīng)并保存用于未來應(yīng)用的PSC，分離多能細(xì)胞和分化細(xì)胞的細(xì)胞分選方法已經(jīng)得到應(yīng)用。熒光活化細(xì)胞分選 (FACS) 和微孔粘附是流行的高通量方法，用于基于定義的多能性特征分離細(xì)胞，多能性標(biāo)記陽(yáng)性干細(xì)胞的選擇性通過細(xì)胞培養(yǎng)條件得到增強(qiáng)。對(duì)于iPSC，當(dāng)添加四種抑制劑的小分子混合物 (SMC4培養(yǎng)基) 時(shí)，分選后觀察到SSEA4/ tra181陽(yáng)性iPSC克隆比在傳統(tǒng)重編程培養(yǎng)基中分選的細(xì)胞衍生克隆增加55倍。盡管FACS是高度自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的，但分選單個(gè)細(xì)胞、以產(chǎn)生穩(wěn)定的多能細(xì)胞克隆仍然是一項(xiàng)勞動(dòng)密集型且耗時(shí)的工作。因此，能夠產(chǎn)生多能細(xì)胞群體作為池培養(yǎng)的方法是首選的，因?yàn)槌乜梢员３侄嗄軜?biāo)記物的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。為此，使用細(xì)胞表面標(biāo)記抗體的磁激活細(xì)胞分選 (MACS) 方法已被用于生成iPSCs池。在這種情況下，用TRA-1-60和SSEA4抗體進(jìn)行一輪異質(zhì)性細(xì)胞池分選后，TRA1-60和SSEA4陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量分別增加了28%和11%。另外幾輪的MACS進(jìn)一步富集了表達(dá)多能性標(biāo)記的細(xì)胞群體。一般來說，MACS是比FACS更好的方法，因?yàn)樗梢暂p松快速地同時(shí)在多個(gè)樣品上進(jìn)行，同時(shí)僅對(duì)細(xì)胞施加較小的剪切應(yīng)力。
盡管細(xì)胞分選方法在基于形態(tài)學(xué)和表面標(biāo)志表征干細(xì)胞群體方面是有效的，但目前廣泛采用細(xì)胞分選方法分離動(dòng)物或臨床研究級(jí)多能干細(xì)胞仍受到阻礙。這主要是由于GMP級(jí)抗體的高成本以及臨床級(jí)FACS儀器和專業(yè)知識(shí)的有限可用性。因此，在未來的細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)中，需要可放大的平臺(tái)來生成可靠、均一且安全的臨床級(jí)多能干細(xì)胞群體。
最佳iPSC培養(yǎng)基及培養(yǎng)基的開發(fā)
在擴(kuò)增過程中控制iPSC質(zhì)量的關(guān)鍵一步是在生物工藝中使用良好表征的材料，其中細(xì)胞培養(yǎng)基和基質(zhì)起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞培養(yǎng)基通過提供營(yíng)養(yǎng)、礦物質(zhì)和pH的良好平衡，對(duì)維持健康、增殖的細(xì)胞至關(guān)重要。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)被用作細(xì)胞粘附和增殖的支架，基質(zhì)通常被飼養(yǎng)層細(xì)胞或生長(zhǎng)支持因子包裹，以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。使用完全表征的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)于控制良好的生物工藝過程至關(guān)重要，特別是對(duì)于生產(chǎn)臨床級(jí)生物樣品。在過去的十年中，通過考慮有助于維持iPSC細(xì)胞系多能性和整體工藝可放大性的信號(hào)通路，iPSC培養(yǎng)基配方和基質(zhì)已經(jīng)得到顯著的發(fā)展。
當(dāng)涉及到為iPSC設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)，一種策略方法是確定多能性依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中涉及的內(nèi)在生長(zhǎng)因子。調(diào)控干細(xì)胞多能性基因水平的途徑多種多樣，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-ß超家族激活級(jí)聯(lián)、受體酪氨酸激酶信號(hào)通路 [堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的下游]、涉及胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)的途徑等。有趣的是，mESC中足以維持多能性的蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子 (即骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) 和白血病抑制因子 (LIF) )不同于hESC。多能干細(xì)胞在多能性和自我更新維持方面也可能需要不同的生長(zhǎng)因子。例如，bFGF已被確定為維持體外hESC自我更新的關(guān)鍵添加物，在無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)物中其濃度從40 ng/ml到100 ng/ml不等。與hPSC自我更新有關(guān)的還有典型的Wnt/b-catenin信號(hào)，雖然單獨(dú)添加Wnt3a不足以在沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下維持未分化的hESC。鑒于這些代謝研究是在hESC上進(jìn)行的，而不是在iPSC上進(jìn)行的，因此需要對(duì)iPSC進(jìn)行更深入的表征，以設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，并考慮為臨床應(yīng)用而開發(fā)的每種新細(xì)胞系的獨(dú)特要求。
通過提供特定干性支持因子以及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)富集環(huán)境，以飼養(yǎng)層細(xì)胞為基礎(chǔ)的基質(zhì)可防止干細(xì)胞自發(fā)分化，并改善ESC和/或iPSC的附著。支持PSC最常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞是增殖失活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生多種對(duì)多能性維持至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，如TGF-β1、激活素A、BMP-4、多營(yíng)養(yǎng)因子(肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子)等。然而，由于飼養(yǎng)層細(xì)胞的增殖能力有限，重復(fù)傳代后支持iPSC多能性的效率降低，且會(huì)導(dǎo)致iPSC分離過程中的高污染風(fēng)險(xiǎn)，在飼養(yǎng)條件下大規(guī)模生產(chǎn)iPSC時(shí)會(huì)出現(xiàn)相關(guān)技術(shù)挑戰(zhàn)。此外，動(dòng)物源性飼養(yǎng)基質(zhì)可能增加人畜共患病原體和未知病毒向宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)排斥反應(yīng)。因此，iPSC培養(yǎng)方法主要側(cè)重于通過使用ECM蛋白、條件培養(yǎng)基或合成生物材料而過渡到無(wú)動(dòng)物成分和無(wú)細(xì)胞 (稱為“無(wú)飼養(yǎng)”) 的培養(yǎng)系統(tǒng)。
隨著培養(yǎng)基的發(fā)展，在過去的十年中，iPSC細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)逐步達(dá)到了cGMP標(biāo)準(zhǔn)。最近的一項(xiàng)iPSC研究表明，長(zhǎng)期使用動(dòng)物源性血清和含xeno分子會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)、擴(kuò)增潛力、基因表達(dá)和細(xì)胞因子譜。這推動(dòng)了xeno-free培養(yǎng)基 (XFM) 配方的開發(fā)，隨后是無(wú)動(dòng)物源性成分 (ACF) 培養(yǎng)基，以支持iPSC擴(kuò)增。在已開發(fā)的ACF培養(yǎng)基類型中，Essential 8TM (Thermo Fisher Scientific)培養(yǎng)基是iPSC培養(yǎng)中使用最多的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因?yàn)樗?種干細(xì)胞增殖最必需的元素：DMEM/F12、L -抗壞血酸、磷酸鎂、硒鈉、FGF-2、胰島素、NaHCO3以及轉(zhuǎn)鐵蛋白、TGF-β1或Nodal。
無(wú)飼養(yǎng)iPSC擴(kuò)增方法的發(fā)展促進(jìn)了未來自動(dòng)化生產(chǎn)的可能性。事實(shí)上，使用CompacT SelecTTM細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在無(wú)飼養(yǎng)條件下，大規(guī)模自動(dòng)化生產(chǎn)未分化的iPSC是可行的。在這種情況下，使用含有Activin A和FGF-2的化學(xué)限定培養(yǎng)基 (CDM) 自動(dòng)傳代的聚體hiPSC可保持其特征形態(tài)和多能性標(biāo)記物的表達(dá)。生物材料也被探索作為無(wú)飼養(yǎng)iPSC培養(yǎng)系統(tǒng)的增強(qiáng)基質(zhì)。例如，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，基于水凝膠的基質(zhì)存在最佳彈性 (25 kPa)，使細(xì)胞保持多能性。進(jìn)一步的研究表明，接枝到水凝膠 (儲(chǔ)存模量為25 kPa) 上的雙鏈體外連接素衍生的寡肽支持hESC和iPSC的長(zhǎng)期生長(zhǎng)，可超過10代。ECM，如纖維連接蛋白、層粘連蛋白和玻璃體連接蛋白，或來自ECM的寡肽，具有特定的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這使得它們成為支持iPSC在無(wú)飼養(yǎng)基質(zhì)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的重要成分。3D生物打印和細(xì)胞/組織打印技術(shù)也為未來的工藝放大和自動(dòng)化解鎖了可能性。最近，當(dāng)iPSC在涂有纖維連接蛋白的無(wú)飼養(yǎng)殼聚糖或聚氨酯膜上馴化和擴(kuò)增時(shí)，證明了細(xì)胞打印技術(shù)的有效性。在這項(xiàng)研究中，嵌入熱敏聚氨酯 (PU) 水凝膠基質(zhì)的iPSC顯示出更高的活性。然而，進(jìn)一步優(yōu)化基于聚合物的無(wú)飼養(yǎng)基質(zhì)是必要的，因?yàn)镻U水凝膠培養(yǎng)的多能性標(biāo)記 (即OCT4和NANOG) 與對(duì)照MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)不同。
細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)不僅決定了iPSC的最終行為，而且決定了整個(gè)生物工藝的成本。盡管在具有監(jiān)測(cè)和反饋控制pH值和溶氧 (DO) 能力的一次性多層培養(yǎng)器皿中已經(jīng)證明了在2D靜態(tài)培養(yǎng)中大規(guī)模生長(zhǎng)hPSC的可行性，但在2D或3D靜態(tài)基質(zhì)上大規(guī)模生產(chǎn)hPSC仍然是一種成本、勞動(dòng)力和空間密集的方法。已知靜態(tài)培養(yǎng)條件也會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基成分、代謝廢物、旁分泌因子和氣體的不利梯度。主要的共識(shí)是，動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用所需的多能干細(xì)胞密度的最佳方法，目前正在積極開發(fā)高效且可放大的懸浮多能干細(xì)胞擴(kuò)增的新策略。例如，可以利用成功的、基于基質(zhì)的研究來設(shè)計(jì)最佳懸浮培養(yǎng)模式。
iPSC懸浮方式的關(guān)鍵考慮因素 (聚集體、微載體和微膠囊)
無(wú)基質(zhì)的iPSC懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)克服了靜態(tài)基質(zhì)可放大性有限的挑戰(zhàn)，同時(shí)支持iPSC生長(zhǎng)和多能狀態(tài)。由于iPSC的貼壁性質(zhì)，當(dāng)它們?cè)趹腋◇w系中接種和擴(kuò)增時(shí)，3D聚集體 (或球體) 會(huì)自發(fā)形成。iPSC聚集體與胚狀體 (EB) 非常相似，因此可以作為擴(kuò)增后直接譜系分化的一種有用方式。iPSC聚集體的生長(zhǎng)和多能性主要取決于微環(huán)境、聚集體大小分布和細(xì)胞培養(yǎng)罐大小。有研究對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使hiPSC在轉(zhuǎn)瓶的E8TM無(wú)飼養(yǎng)條件下，以未分化懸浮細(xì)胞聚集體擴(kuò)增，超過10代。從那時(shí)起，攪拌懸浮培養(yǎng)已擴(kuò)大到3000 ml的一次性生物反應(yīng)器 (1000ml工作體積)，以產(chǎn)生大量的hiPSC聚集體 (多達(dá)2x10^9個(gè)細(xì)胞)，同時(shí)保留多能狀態(tài)標(biāo)記物的表達(dá)，包括TRA-1-81、SSEA-4、OCT4和SOX2。
然而，在動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)中擴(kuò)增iPsc聚集體存在局限性。與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)相比，擴(kuò)增率降低，聚集體大小形成不均一。如果不加以控制，細(xì)胞大團(tuán)塊 (>800 um) 的形成會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性、自發(fā)分化、營(yíng)養(yǎng)和氧氣擴(kuò)散梯度，以及整體擴(kuò)增過程減慢。通過優(yōu)化攪拌槳類型和攪拌速度，可以控制iPSC培養(yǎng)中的聚集體尺寸。新型生物反應(yīng)器系統(tǒng)的一個(gè)例子是垂直輪生物反應(yīng)器（VWBR），可在擴(kuò)增iPSC的同時(shí)降低聚集體的大小，其中，攪拌由垂直葉輪提供，因此可以實(shí)現(xiàn)容器的高效均質(zhì)化。使用該系統(tǒng)，在保持多能性的同時(shí)，產(chǎn)生了平均直徑為350 um的聚集體 (最高密度2.3x10^6 cells/ml)。
培養(yǎng)基添加物也會(huì)影響聚集體的形成。例如，在hiPSC聚集體擴(kuò)增過程中，短期使用維甲酸 (RA) 處理可進(jìn)一步維持多能性。類維生素A通過增加多能依賴性轉(zhuǎn)錄因子(Nanog和Oct4)的表達(dá)和激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信號(hào)通路來支持iPSC自我更新。此外，化學(xué)限定培養(yǎng)基中添加Rho相關(guān)的卷曲螺旋激酶 (ROCK) 抑制劑Y27632可以促進(jìn)多種懸浮罐類型中從單細(xì)胞接種開始iPSC聚集體的形成。卷曲螺旋激酶抑制劑通過減少解離誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和提高克隆效率來支持干細(xì)胞聚集體的存活。然而，最近的研究表明，長(zhǎng)期暴露于ROCK抑制劑會(huì)改變iPSC的代謝。因此，培養(yǎng)基添加、接種策略和生物反應(yīng)器設(shè)置是優(yōu)化提高生物工藝產(chǎn)量的關(guān)鍵參數(shù)。通過進(jìn)一步優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)足夠臨床應(yīng)用的iPSC聚集體的大規(guī)模生產(chǎn)。在這種模式下，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸機(jī)制和聚集體的大小分布都需要改進(jìn)，以保持高密度下細(xì)胞聚集體的多能性和活力。
微載體
在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中加強(qiáng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的工作已經(jīng)在微載體的實(shí)施方面取得了進(jìn)展。微載體的優(yōu)點(diǎn)是提供了一個(gè)表面積來支持PSC的生長(zhǎng)和附著，同時(shí)保持了動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。微載體可以用于細(xì)胞種子制備，如果是可生物降解的，也可以在治療過程中最終用于將細(xì)胞運(yùn)送到所需的受損組織。各種生物可降解材料通常被用于生產(chǎn)針對(duì)細(xì)胞系擴(kuò)增的微載體，包括葡聚糖、膠原蛋白、明膠、聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)、聚l-乳酸(PLLA)、聚苯乙烯(PS)和羥基磷灰石(HA)。與較大的靜態(tài)基質(zhì)類似，微載體通過其表面電荷的適當(dāng)聯(lián)系，以及當(dāng)被ECM蛋白(如玻璃體連接蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白)包裹時(shí)，為PSC的生長(zhǎng)提供進(jìn)一步增強(qiáng)的支持，攪拌微載體培養(yǎng)系統(tǒng)已被證明可以促進(jìn)貼壁依賴性干細(xì)胞的擴(kuò)增和規(guī)模放大，同時(shí)為監(jiān)測(cè)和控制干細(xì)胞健康和分化提供必要的工具。通過增強(qiáng)氧氣供應(yīng)和代謝物質(zhì)量運(yùn)輸以及降低微環(huán)境毒性來提高PSC的產(chǎn)量。
然而，在使用微載體擴(kuò)增hiPSC時(shí)，需要考慮一些問題。微載體的限制取決于它們的直徑(100- 400um)、密度(通常為-1 g/ml)和化學(xué)成分，它們會(huì)影響細(xì)胞附著，從而影響擴(kuò)增能力。由于微球的表面積有限，hiPSC的峰值密度似乎受到微球與細(xì)胞比例的限制。粘附在微載體微球上的細(xì)胞也需要酶解和過濾，這可能會(huì)犧牲細(xì)胞的活力和多能性，具體取決于所使用的方法。為了緩解這一問題，生物可降解微載體正在開發(fā)中。與傳統(tǒng)的PS微載體相比，無(wú)異源可溶微載體的開發(fā)最近取得了不小的進(jìn)展，使轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞回收率大大提高。
攪拌式生物反應(yīng)器還會(huì)對(duì)微載體微球施加流體動(dòng)力剪切應(yīng)力，從而影響hiPSC的整體健康和多能性。這可以通過優(yōu)化生物反應(yīng)器工藝參數(shù) (即攪拌速率) 來克服，以盡量減少剪切應(yīng)力對(duì)iPSC的影響。例如，Gupta及其同事證明，在轉(zhuǎn)瓶中，iPSC在微載體上的長(zhǎng)期附著、多能性和擴(kuò)增依賴于保持25 RPM的最佳攪拌速度。這種參數(shù)優(yōu)化方法需要應(yīng)用于更大規(guī)模的iPSC擴(kuò)增 (即生物反應(yīng)器)。
制造微載體微球的成本是另一個(gè)需要考慮的問題，因?yàn)楦鶕?jù)所使用的材料和添加劑，該工藝可能會(huì)變得異常昂貴。因此，重要的是微載體材料具有成本效益，如果可能的話 - 可回收，并且在每次生產(chǎn)運(yùn)行后可消毒。使用控制良好的生物工藝系統(tǒng)，基于微載體的iPSC培養(yǎng)方法正在開發(fā)中，用于細(xì)胞治療和組織工程中人類iPSC的持續(xù)擴(kuò)增和回收。
利用微載體制備人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC) 的生物工藝研究進(jìn)展，典型工藝包括靜態(tài)培養(yǎng)、放大工藝、下游工藝和制劑，微載體通常在放大過程中引入，在下游工藝過程中去除。
微膠囊化
微膠囊與將細(xì)胞附著在微球表面的微載體不同，微膠囊化涉及將細(xì)胞捕獲在球形膠囊內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和其它生長(zhǎng)因子可以通過球形膠囊擴(kuò)散。球形膠囊由半透性材料或膜組成，在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中可以保護(hù)細(xì)胞免受聚團(tuán)和剪切力的影響。用于生成微膠囊的生物材料包括海藻酸鹽、瓊脂糖、尼龍、膠體、聚苯乙烯、丙烯酸酯、聚賴氨酸-海藻酸鹽水凝膠、醋酸纖維素-乙基纖維素和聚酯膜。通常通過乳化或擠壓方法捕獲細(xì)胞，形成保護(hù)管，使細(xì)胞增殖。總的來說，聚合物微膠囊與凝膠微膠囊相比具有一定的優(yōu)勢(shì)，包括生物相容性和GMP相容性。每單位體積的膠囊材料可以容納更多的細(xì)胞，并且由于在膠囊內(nèi)空間存在液體細(xì)胞懸浮液，聚合物膠囊中的顆粒間擴(kuò)散限制不那么嚴(yán)重。
在微膠囊系統(tǒng)中培養(yǎng)的干細(xì)胞既可以維持多能性，也可以被誘導(dǎo)分化，這取決于其膠囊的組成和微環(huán)境中存在的生長(zhǎng)因子。微膠囊化技術(shù)在大規(guī)模生產(chǎn)中所面臨的缺點(diǎn)與微載體類似，即制造成本和有限的表面積。此外，一些干細(xì)胞類型，如hMSC，在沒有添加肽或蛋白質(zhì)（如纖連蛋白）的情況下被包裹時(shí) (例如，在海藻酸鹽中) 增殖困難，前者可改善細(xì)胞附著。相比之下，如果細(xì)胞附著增強(qiáng)，在收獲過程中回收被包裹的細(xì)胞可能會(huì)帶來更困難的挑戰(zhàn)。
原文：A.Polanco, B.Kuang, S.Yoon, Bioprocess Technologies that Preserve the Quality of iPSCs. Trends in Biotechnology, 2020.