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間充質(zhì)干細胞治療的有效性與安全性已在多種疾病中得到證實。然而成體來源的間充質(zhì)干細胞其體外擴增能力有限性、分離細胞的高異質(zhì)性導致的臨床結(jié)果的不穩(wěn)定性等問題亟待解決。將iPSC通過特定實驗路線誘導分化為iPSC衍生的間充質(zhì)樣MSC（iPSC-MSC），是最有潛力替代成體MSC的產(chǎn)品。許多研究證明iPSC可以通過多種分化策略獲得iPSC-MSC，且經(jīng)研究表明iPSC-MSC與成體MSC相比，其增殖能力、免疫調(diào)節(jié)能力、生物學效能等特點均優(yōu)于成體MSC或與之相當。
筆者試圖通過檢索相關文獻資料，從iPSC-MSC制備的方法學研究、iMSC產(chǎn)品在不同疾病模型中的應用、臨床級iPSC衍生細胞制品的最新研究進展以及新一代的iPSC衍生產(chǎn)品的開發(fā)策略等四個方面，與廣大讀者探討此類細胞治療產(chǎn)品的開發(fā)前景，拋磚引玉，以期展開對類似管線的開發(fā)前景的討論，從而豐富產(chǎn)品開發(fā)思路。
再生醫(yī)學和細胞治療已成為當今世界各國先進生物醫(yī)療技術關注的焦點，其中間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cell, MSC）療法潛力無限，已被證明在多種疾病的臨床試驗研究中具備安全性和有效性，廣受關注。MSC屬于成體多能干細胞，因其多向分化潛能高、免疫原性低及倫理問題少和來源廣泛等特點，一直作為干細胞研究的重要方向[1]。MSC具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、支持造血功能、組織修復等功能特性[2]，可應用于自身免疫性疾病如紅斑狼瘡、炎性疾病如骨關節(jié)炎、衰老相關疾病、感染性疾病的治療[3]。然而由于不同的MSC細胞來源、供體情況不同、培養(yǎng)體系差異等造成的細胞異質(zhì)性、體外擴增能力的有限性、分離提取的難度與局限性等[4]，使得MSC細胞療法在臨床應用方面存在一些限制和效果的不穩(wěn)定[5]。
由iPSC獲得iPSC-MSC的方法學研究進展
筆者匯總了目前市面上的主流iPSC衍生MSC（iMSC）的制備方法[6]。分化方向大致可歸類為三個方面，主流分化策略包括：MSC培養(yǎng)基替換誘導法、信號通路調(diào)節(jié)誘導法及擬胚體法等[7]。在下文中，對每種報道的研究方案使用的關鍵物料與方法細節(jié)進行了詳細描述，各項研究也對衍生的iMSC進行了細胞表面標志物與多向分化潛能的評估，同時也針對每種方案的整體分化時間做了統(tǒng)計，以期找到一種高效且安全的可用于工業(yè)化生產(chǎn)的分化方案。
（1）MSC培養(yǎng)基替換誘導法通過將iPSC培養(yǎng)基更換為MSC培養(yǎng)體系，能夠誘導iPSC的自發(fā)分化，起到對細胞的誘導和篩選作用。MSC基礎培養(yǎng)基成分包括高/低糖DMEM、KO-DMEM（特定成分敲除的DMEM）、DMEM-F12和α-MEM等，同時配合加入FBS、KOSR、L-谷氨酰胺、P/S、非必需氨基酸和FGF等。Kang[8]等人報道，將iPSC培養(yǎng)基直接替換為含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基作用兩周，傳代后在預包被培養(yǎng)皿中對細胞持續(xù)傳代，可獲得成纖維細胞形態(tài)的iMSC細胞[9]。類似的誘導條件，使用α-MEM培養(yǎng)基[20]也能夠獲得。利用本法的整體誘導效率較低，如獲得合格表型的iMSC（高表達 CD73、CD44、CD105、CD90；低表達CD19、CD34、CD45、HLA-DR等），且具備三系分化能力[10]，時間都要長達30-50天。
（2）信號通路調(diào)節(jié)劑誘導iMSC形成通路抑制劑法是iPSCs誘導MSCs的一類常用方法，可快速高效的將iPSC誘導至MSC細胞表型并具有間充質(zhì)干細胞功能。用于iPSC-MSCs誘導的抑制劑包括SB203580（p38-MAPK抑制劑）、SB431542（TGF-β抑制劑）、CHIR（GSK3抑制劑）、β-巰基乙醇、b-FGF等。
-SB203580
SB203580是一種吡啶咪唑類p38 MAPK抑制劑，對GAK、CK1、RIP2、c-Raf 和 GSK3等激酶也有抑制活性。p38-MAPK途徑可促進MSC分化為表皮樣細胞[11]，還可以抑制IL-2介導的T細胞增殖作用，在體內(nèi)參與多種炎癥反應或誘導細胞自噬。有文章報道SB203580能夠促進iPSC細胞向中胚層表型的轉(zhuǎn)化[12]，通過將iPSC懸浮形成擬胚體（EB），并在培養(yǎng)體系中加入一定濃度SB203580誘導擬胚體，將誘導后的擬胚體貼壁培養(yǎng)傳代，28天后獲得表面標志物合格的iMSC細胞，且傳代20代后核型完整且細胞未衰老。
-SB431542
SB431542是TGF-β信號通路抑制劑，TGF信號通路是維持干細胞多能性的主要信號通路，抑制TGF通路可以誘導ESC和iPSC分化為MSC或神經(jīng)元細胞[13]。Glaeser等人使用20 μM的SB431542經(jīng)10-14天將ESC分步誘導為神經(jīng)嵴細胞，再轉(zhuǎn)換為有血清培養(yǎng)體系將神經(jīng)嵴細胞向MSC樣細胞轉(zhuǎn)化[14]。Lee和Sun[15]等人在整個iMSC誘導過程中均加入10 μM SB431542，傳代若干次后均獲得具有三系分化能力的iMSC細胞系。不同研究者使用的SB431542作用濃度從1 μM向20 μM不等[16]，對iMSC的誘導效率未見明顯差異。
-CHIR-99021
CHIR-99021是一種高度特異的糖原合成酶激酶-3（GSK-3）抑制劑，被證明可以促進BALB/c小鼠ES細胞的自我更新并維持其多能性。CHIR-99021涉及包括Wnt/β-catenin、TGF-β、Nodal和MAPK等多種信號通路[17]。不同濃度的CHIR99021常與 SB431542聯(lián)合應用于iMSC的誘導分化。Harada等人[18]使用10 μM SB431542＋1 μM CHIR99021的化合物組合，按iPSC-神經(jīng)嵴細胞-MSC樣細胞的路線在21天左右成功誘導出間充質(zhì)表型細胞。
Winston等人[19]則使用4 μM SB431542＋4 μM CHIR99021＋10 ng/mL β-FGF在25天左右獲得了iMSC。信號通路調(diào)節(jié)劑的加入與MSC培養(yǎng)基直接轉(zhuǎn)換相比，誘導iMSC成熟的效率更高，整體分化時間被有效縮短，且獲得的細胞無論從表型、三系分化能力及基因組表達方面，均與原代MSC細胞無明顯差異[20]。
-β-巰基乙醇
β-巰基乙醇也是iMSC誘導過程中的常用添加物。Liang、McGrath、Hua和Lim等人，分別在iPSC培養(yǎng)體系中加入了濃度不同的β-巰基乙醇（終濃度分別為55 uM，0.1 mM，110mM[21]），30天左右獲得成纖維樣的iMSC細胞，經(jīng)鑒定細胞表面標志物與三系分化能力與BM-MSC相似。
（3）擬胚體法通過擬胚體（EB）介導的iMSC分化路徑，能夠在有限的培養(yǎng)體積中收獲更多的目的細胞，有利于工業(yè)化和成本控制。然而培養(yǎng)過程整體需要的時間較長，且產(chǎn)生的細胞存在一定的異質(zhì)性。研究者們通常在擬胚體形成及iMSC爬出階段，在培養(yǎng)體系中加入化合物通路調(diào)節(jié)劑，以提高細胞向iMSC的富集效率。
Chen YS使用含有20% KOSR及0.1 μg/mL bFGF的DMEM-F12培養(yǎng)基，將iPSC懸浮培養(yǎng)形成EB，之后體系中加入10 μM濃度的SB431542以促進細胞爬出，接著經(jīng)細胞傳代獲得iMSC [22]。Zhou等[23]開發(fā)了一種在生物反應器中大規(guī)模擴增胚胎干細胞的方法，將ESC懸浮培養(yǎng)后獲得大量EB，接著使用含有KOSR的體系誘導EB分化，進一步誘導EB爬出，獲得ES-MSC。研究者還進一步優(yōu)化誘導體系，開發(fā)了誘導分化的新配方，在體系中添加一定濃度的b-FGF與TGFβ-1促進ES-MSC的爬出與成熟[24]。另外，包括Activin A，VEGF，BMP4，RA[25]等細胞因子也應用于經(jīng)擬胚體分化的誘導過程中，分化天數(shù)在20-30天時間不等。