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來源：生物世界（ID：ibioworld）
CRISPR 基因編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著很多應(yīng)用，從治療遺傳疾病、癌癥，到農(nóng)業(yè)育種、核酸檢測等等。CRISPR 基因編輯依賴于其兩種組分，向?qū)?RNA（guide RNA，gRNA）負責(zé)識別和靶向目標位點，Cas 酶負責(zé)對目標位點的切割。CRISPR-Cas9 是應(yīng)用最為廣泛的 CRISPR 系統(tǒng)，但越來越多研究顯示，其對 DNA 的直接切割具有潛在風(fēng)險。
近年來，越來越多的 CRISPR-Cas 家族被相繼發(fā)現(xiàn)，其中 CRISPR-Cas13 是新型 CRISPR 工具中的耀眼新星（尤其是 Cas13d）。與 Cas9 不同的是，Cas13 是靶向切割 RNA。RNA 靶向的 CRISPR 系統(tǒng)為開發(fā)新一代的基因編輯療法帶來了巨大希望。
2023 年 7 月 3 日，紐約大學(xué)和哥倫比亞大學(xué)的研究人員在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Prediction of on-target and off-target activity of CRISPR–Cas13d guide RNAs using deep learning 的研究論文。
研究團隊將深度學(xué)習(xí)技術(shù)與 CRISPR 篩選相結(jié)合，開發(fā)了一種人工智能（AI）平臺——TIGER，可以預(yù)測 RNA 靶向的 CRISPR 系統(tǒng)（CRISPR-Cas13d）的上靶和脫靶活性，還能實現(xiàn)對基因表達水平的精確調(diào)控。這項新技術(shù)為 CRISPR 基因編輯療法中的精準基因調(diào)控鋪平了道路，也進一步推動了 RNA 靶向的 CRISPR 系統(tǒng)在人類遺傳學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)方面的廣泛適用性。
論文通訊作者 Neville Sanjana 表示，隨著從 CRISPR 篩選中收集到更大的數(shù)據(jù)集，應(yīng)用復(fù)雜機器學(xué)習(xí)模型的機會越來越快。有了 TIGER 模型，我們可以預(yù)測脫靶活性，還能實現(xiàn)對特定基因表達水平的精確調(diào)控，這使得 RNA 靶向的 CRISPR 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多令人興奮的新應(yīng)用成為可能。
RNA 靶向的 CRISPR 系統(tǒng)有著廣泛的應(yīng)用前景，例如，RNA 編輯、靶向敲低 mRNA 來抑制特定基因表達、進行藥物的高通量篩選、識別非編碼 RNA 的功能，還可以用來預(yù)防或治療 RNA 病毒的感染。
高精度是治療性 RNA 靶向的 CRISPR 技術(shù)安全性的關(guān)鍵，要想推進 Cas13 的臨床應(yīng)用，需要實現(xiàn)兩個關(guān)鍵目標——最大化上靶活性（on-target）、最小化脫靶活性（off-target）。脫靶活性包括 gRNA 和目標 RNA 的錯配（mismatches），以及產(chǎn)生的插入和缺失突變（indels）。
然而，早期針對 RNA 靶向的 CRISPR 系統(tǒng)的研究主要集中在上靶活性和錯配上，而對脫靶活性的預(yù)測，特別是插入和缺失突變，還沒有得到很好的研究。在人類中，大約五分之一的基因突變屬于插入或缺失突變，所以這是 CRISPR 設(shè)計中需要考慮的重要的潛在脫靶類型。
在這篇最新論文中，Neville Sanjana 團隊在人類細胞中進行了一系列 RNA 靶向 CRISPR 篩選實驗，在多個人類細胞系中檢測了 20 萬個靶向必需基因的 gRNA 的活性，包括完美匹配的 gRNA，以及導(dǎo)致錯配、插入或缺失突變的脫靶 gRNA。從而生成了一個大型 Cas13d 數(shù)據(jù)集，對 Cas13d gRNA 的上靶和脫靶活性進行了全面評估。
Neville Sanjana 團隊與機器學(xué)習(xí)專家、哥倫比亞大學(xué)計算機科學(xué)助理教授 David Knowles 合作，通過上述數(shù)據(jù)訓(xùn)練了一個深度學(xué)習(xí)模型，將其命名為 TIGER（Targeted Inhibition of Gene Expression via gRNA design）。將深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測生成的結(jié)果與在人類細胞中進行的實驗室測試相比較，TIGER 能夠準確預(yù)測上靶活性和脫靶活性，這也成為了第一個預(yù)測 RNA 靶向的 CIRSPR 系統(tǒng)的脫靶活性的工具。
論文共同通訊作者 David Knowles 表示，利用現(xiàn)代高通量實驗產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)集，機器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)正在基因組學(xué)領(lǐng)域顯示出巨大優(yōu)勢。更重要的是，我們還能夠使用“可解釋的機器學(xué)習(xí)”來理解為什么該模型能夠很好地預(yù)測 gRNA 的效果。Neville Sanjana 實驗室之前的研究展示了如何設(shè)計能夠敲低特定 RNA 的 Cas13 gRNA，而現(xiàn)在有了 TIGER，就可以進一步指導(dǎo)對 Cas13 gRNA 的設(shè)計，在靶向敲低和避免脫靶活性之間取得平衡。通過將人工智能（AI）與 RNA 靶向的 CRISPR 篩選相結(jié)合，研究團隊設(shè)想 TIGER 的預(yù)測將有助于避免不希望的脫靶活性，進一步促進新一代 RNA 靶向療法的發(fā)展。
在這項最新研究中，研究團隊還證明了，TIGER 的脫靶預(yù)測可以用來精確地調(diào)控基因表達水平，通過錯配 gRNA 實現(xiàn)對特定基因的部分表達抑制。這對于許多由于基因拷貝數(shù)增加導(dǎo)致的疾病具有重要意義，例如唐氏綜合征、某些類型的精神分裂癥、腓骨肌萎縮癥，以及一些因為基因異常表達導(dǎo)致的癌癥。
▲圖｜使用TIGER來設(shè)計gRNA，實現(xiàn)對基因表達水平精確調(diào)控
總的來說，該研究開發(fā)了的 AI 預(yù)測模型增強了我們對 gRNA 靶向特異性和避免脫靶的理解，還能在一定程度上實現(xiàn)對基因表達水平的精確調(diào)控。這項研究進一步推動了 RNA 靶向的 CRISPR 系統(tǒng)在人類遺傳學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)方面的廣泛適用性。
論文鏈接：1.https://www.nature.com/articles/s41587-023-01830-8