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來源：BioArt
細(xì)胞命運(yùn)可塑性是一個(gè)重要的科學(xué)問題。利用過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或使用化學(xué)小分子組合等策略，可以將已分化的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC），這一技術(shù)被稱為體細(xì)胞重編程【1-13】。相較于轉(zhuǎn)錄因子，小分子具有易于操控、不插入基因組、處理可逆等優(yōu)點(diǎn)；因此，使用純粹小分子組合的化學(xué)重編程是一種研究細(xì)胞命運(yùn)可塑性的重要體系。干細(xì)胞化學(xué)生物學(xué)做為新興交叉學(xué)科，利用小分子體外及在體精準(zhǔn)調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)、狀態(tài)、功能等，在基礎(chǔ)研究、抗衰老、抗腫瘤、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景，化學(xué)重編程是其焦點(diǎn)之一。然而，目前已報(bào)道的化學(xué)重編程體系在速率上與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子重編程存在差距，仍有較大提升空間；化學(xué)重編程在分子軌跡上與轉(zhuǎn)錄因子重編程存在較大差異，說明化學(xué)重編程機(jī)制上的獨(dú)特性；目前化學(xué)重編程過程的具體分子機(jī)制極不清晰，有待深入發(fā)掘。
2023年8月7日，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院祝賽勇實(shí)驗(yàn)室在Nature Cell Biology發(fā)表題為 A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state 的研究論文，首次報(bào)道了細(xì)胞快速化學(xué)重編程（Fast chemical reprogramming, FCR）。該研究中作者致力于改造小鼠化學(xué)重編程體系，通過采取多種策略，篩選了2萬多個(gè)條件，自主研發(fā)創(chuàng)建了FCR，大幅度加快了細(xì)胞命運(yùn)重塑進(jìn)程，將原先約40天的過程縮短至7-12天，實(shí)現(xiàn)了最快1周的質(zhì)的飛躍。在此基礎(chǔ)上，利用多組學(xué)測(cè)序及整合分析，系統(tǒng)性地展現(xiàn)了FCR過程中的轉(zhuǎn)錄與表觀遺傳動(dòng)態(tài)，并揭示FCR后期經(jīng)歷了一個(gè)獨(dú)特的滯育類似狀態(tài)。有意思的是，作者還發(fā)現(xiàn)了異染色質(zhì)組蛋白修飾H3K9me3通過調(diào)控多能性相關(guān)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒ERVs從而作為重編程障礙的獨(dú)特機(jī)制。FCR過程中，細(xì)胞感受外源信號(hào)，克服重重障礙，“破繭成蝶”，華麗轉(zhuǎn)身。
從解決化學(xué)重編程周期長(zhǎng)、效率低等關(guān)鍵問題出發(fā)，博士生陳希獨(dú)辟蹊徑，采取了一個(gè)與以往研究不同的篩選策略，以最終生成iPSC效率為篩選指標(biāo)，通過在化學(xué)重編程三個(gè)階段分別篩選約7000個(gè)小分子，發(fā)現(xiàn)了一系列有效小分子可以顯著提高重編程效率：第一階段發(fā)現(xiàn)了SR11237、CD3254和CCT129202，第二階段發(fā)現(xiàn)了TSA、TMP269、Citarinostat、 DMH1、AZD9291 mesylate和SGC-CBP30，第三階段發(fā)現(xiàn)了小分子Vc和WS6。進(jìn)一步測(cè)試發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子mLIF、小分子VPA和R406的作用窗口期為2天，提示化學(xué)重編程過程可以細(xì)分到每2天一個(gè)階段，具備進(jìn)一步優(yōu)化空間。
隨后，綜合運(yùn)用小分子文庫篩選、濃度測(cè)試、處理時(shí)長(zhǎng)測(cè)試、單個(gè)小分子移除試驗(yàn)等手段，通過將有促進(jìn)效果的小分子加入到化學(xué)重編程體系中并調(diào)整其濃度和處理時(shí)間，最終建立了FCR。在FCR過程中，任何階段任一小分子或生長(zhǎng)因子的移除都會(huì)導(dǎo)致iPSC誘導(dǎo)效率的下降，說明這些小分子和生長(zhǎng)因子對(duì)于高效率重編程的必要性。其中，關(guān)鍵多能性基因Oct4在重編程第7天就已經(jīng)被激活，進(jìn)一步說明了FCR的快速性。通過嚴(yán)格的細(xì)胞、分子和功能實(shí)驗(yàn)，作者證明了FCR產(chǎn)生的iPSC具有完備的多能性。這些實(shí)驗(yàn)證明了FCR是一個(gè)快速、高效、安全的不依賴外源轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多能性重編程獲得iPSC的新體系。
那么，在FCR過程中細(xì)胞究竟發(fā)生了哪些翻天覆地的變化呢？為此，作者對(duì)整個(gè)FCR過程8個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣構(gòu)建了多組學(xué)文庫，包括：RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag (H3K27ac、H3K4me3、H3K18la、H3K27me3和H3K9me3)和RRBS，全面地探索了FCR過程中轉(zhuǎn)錄組與表觀遺傳組的動(dòng)態(tài)變化。作者發(fā)現(xiàn)FCR與轉(zhuǎn)錄因子重編程在重編程路徑上有明顯差別，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胚外內(nèi)胚層相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子推動(dòng)了兩個(gè)重編程體系的路徑差異。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CR后期顯著下調(diào)了核糖體、剪切體、DNA復(fù)制相關(guān)基因，這一現(xiàn)象提示了FCR后期可能經(jīng)歷一種滯育類似狀態(tài)。在小鼠中，滯育是一種由環(huán)境因素誘導(dǎo)的特殊囊胚狀態(tài)，引起囊胚細(xì)胞增殖減緩甚至停滯，以及蛋白合成速率降低，并導(dǎo)致胚胎著床延后，這一特殊機(jī)制有助于后代的存活【14】。小鼠胚胎干細(xì)胞也可以通過例如抑制mTOR信號(hào)通路、Myc基因敲除或饑餓等手段誘導(dǎo)一個(gè)滯育類似狀態(tài)，處在該狀態(tài)下的小鼠胚胎干細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯減緩的蛋白翻譯和細(xì)胞增殖速率【15,16】。此外，一部分癌細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)通過進(jìn)入胚胎滯育細(xì)胞的類似狀態(tài)從而獲得化療抵抗能力【17】。然而，滯育類似狀態(tài)是否也存在于體細(xì)胞重編程為iPSC的過程中仍未可知。本研究中，作者通過與體內(nèi)滯育囊胚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較以及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明了FCR在后期經(jīng)歷一種重編程中獨(dú)有的滯育類似狀態(tài)。
為了排除細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)RNA-seq結(jié)果的干擾，作者在FCR的第0、4、8和12天以及iPSC取樣進(jìn)行了scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)FCR依次經(jīng)歷了成纖維細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、中間態(tài)細(xì)胞、新生iPSC和iPSC階段，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)的逐步重塑。通過SCENIC分析和敲低實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)并證明了Stat3和Sox7是FCR的重要的中間態(tài)轉(zhuǎn)錄因子。利用擬時(shí)序分析，作者再次證明了滯育相關(guān)基因在FCR成功重編程途徑后期細(xì)胞中的明顯下調(diào)，并且通過敲低促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入滯育狀態(tài)的關(guān)鍵的基因Larp1、Slc17a5、Prkaa1證明抑制滯育類似狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致FCR效率降低，說明滯育類似狀態(tài)是FCR過程中一個(gè)重要的中間態(tài)，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)多能性網(wǎng)絡(luò)的建立起關(guān)鍵作用。
接下來，作者繼續(xù)抽絲撥繭，整合ATAC-seq和多種組蛋白修飾的CUT&Tag數(shù)據(jù)進(jìn)行了聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)在FCR過程中，動(dòng)態(tài)的染色質(zhì)可及性位點(diǎn)大部分在FCR中呈現(xiàn)高度動(dòng)態(tài)，伴隨著相應(yīng)組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化。即使細(xì)胞經(jīng)歷滯育類似狀態(tài)，細(xì)胞核內(nèi)仍發(fā)生著劇烈的表觀遺傳重塑。進(jìn)一步在全基因組水平上，作者發(fā)現(xiàn)異染色質(zhì)的標(biāo)志性修飾H3K9me3在FCR過程中都富集于基因組上基因稀疏的區(qū)域，這些區(qū)域包含大量ERVs。而在FCR過程中，ERVs的表達(dá)模式也經(jīng)歷了一個(gè)逐步的從MEF向iPSC的動(dòng)態(tài)變化，說明了ERVs可能也會(huì)參與并影響重編程過程。H3K9me3已經(jīng)被證明在多能干細(xì)胞中可以調(diào)控ERVs，因此，作者篩選找到了24個(gè)受H3K9me3調(diào)控的iPSC相關(guān)的ERVs【18】。iPSC相關(guān)的ERVs上有經(jīng)典Oct4-Sox2-Tcf-Nanog這一多能性轉(zhuǎn)錄因子的基序，說明這些ERVs可能參與到多能性網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建中。通過敲低和小分子抑制實(shí)驗(yàn)，作者證明對(duì)H3K9me3甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制可以促進(jìn)FCR，而敲低iPSC相關(guān)ERVs導(dǎo)致FCR效率降低。這些結(jié)果說明H3K9me3通過抑制iPSC相關(guān)的ERVs從而作為FCR的障礙。
圖. 研究模式圖
總的來說，這項(xiàng)研究采用新篩選策略開展大規(guī)模小分子篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列可以促進(jìn)化學(xué)重編程的小分子，并對(duì)這些小分子進(jìn)行最優(yōu)組合和濃度測(cè)試，自主研發(fā)了細(xì)胞快速化學(xué)重編程FCR新體系；利用多組學(xué)整合分析，系統(tǒng)描繪了FCR過程基因表達(dá)和表觀遺傳動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)FCR后期經(jīng)歷獨(dú)特的滯育類似狀態(tài)，并揭示H3K9me3通過抑制多能性相關(guān)ERVs從而阻礙FCR（研究模式圖）。有意義的是，該研究提供了一個(gè)高效快速的細(xì)胞化學(xué)重編程技術(shù)平臺(tái)，并揭示了獨(dú)特的細(xì)胞命運(yùn)重塑機(jī)制，有助于研究者們進(jìn)一步探索和理解細(xì)胞身份建立與維持的基本原理；該研究為化學(xué)重編程技術(shù)的臨床應(yīng)用——利用藥物提高再生能力缺乏或較弱的組織的可塑性從而應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)或延緩衰老——提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
該研究得到了李偉教授、Professor Holger A. Russ、傅君芬教授、何向偉教授、趙小陽教授、王昊教授等的大力幫助。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41556-023-01193-x