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來源：醫(yī)麥客
2023年7月，賓大研究團(tuán)隊(duì)一篇題為Ionizable Lipid Nanoparticles for Therapeutic Base Editing of Congenital Brain Disease的文章進(jìn)一步研究了LNP 作為圍產(chǎn)期大腦中基因編輯平臺(tái)的遞送載體對(duì)于遺傳性CNS （中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病）的適用性，為在圍產(chǎn)期或剛出生的嬰兒進(jìn)行一次性單基因疾病治療提供了腦內(nèi)編輯的可能性。
單基因遺傳病是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的主要原因之一，目前大約有7000到10000種先天性疾病與單基因突變有關(guān)，其中約有17%會(huì)累及神經(jīng)系統(tǒng)，包括神經(jīng)發(fā)育遲緩、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙以及原發(fā)性神經(jīng)元變性等多種先天性腦疾病。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)先天性疾病不僅缺乏特異性診斷指標(biāo)，更缺乏相應(yīng)的治療方法，且往往在胎兒降生前便已發(fā)病，幾乎沒有逆轉(zhuǎn)的可能，所以臨床上多以減輕癥狀或控制疾病進(jìn)展為主。
基因編輯技術(shù)助力單基因疾病治療
隨著基因技術(shù)的發(fā)展，諾獎(jiǎng)級(jí)基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9和堿基編輯平臺(tái)等相繼出現(xiàn)，讓科學(xué)家對(duì)于單基因遺傳病的徹底治療產(chǎn)生了新的想法。早在2019年，費(fèi)城兒童醫(yī)院(CHOP)和賓夕法尼亞醫(yī)學(xué)院的一個(gè)研究小組就利用CRISPR基因編輯技術(shù)，在一種動(dòng)物模型中成功地阻止了一種致命的肺部疾病的發(fā)生，并將研究結(jié)果成功發(fā)表在了Science Translational Medicine上。雖然這只是概念驗(yàn)證性研究，但基因編輯技術(shù)在妊娠中晚期以及不可逆病理過程中治愈或減輕疾病的能力是非常令人興奮的。
天使綜合癥（Angelman syndrome）是攜帶缺陷的母親UBE3A基因的嬰兒會(huì)患上的一種目前無法治愈且治療非常有限的嚴(yán)重神經(jīng)發(fā)育障礙。2020年10月，Nature一篇研究報(bào)告顯示，科學(xué)家們通過CRISPR-Cas9基因療法等技術(shù)修補(bǔ)子宮內(nèi)胎兒大腦的錯(cuò)誤突變，恢復(fù)人類神經(jīng)元培養(yǎng)物中UBE3A基因的功能，能有效甚至可能是永久治療Angelman綜合征模型的缺陷。研究者還證明，這種方法在培養(yǎng)的人類神經(jīng)元中被證實(shí)是有效的。這項(xiàng)研究結(jié)果不僅為后期科學(xué)家們治療Angelman綜合征提供了重要基礎(chǔ)，同時(shí)也為治療其它單基因障礙開辟了道路。
▲AAV介導(dǎo)CRSPR/Cas9對(duì)UBE3A-ATS的敲除恢復(fù)UBE3的表達(dá) （圖片來源：DOI：10.1172/JCI142574）
“天使大作戰(zhàn)”中，研究人員是利用腺相關(guān)病毒（AAV）基因療法將Cas9蛋白運(yùn)輸?shù)紸ngelman綜合征胚胎小鼠模型的大腦中的。雖然多項(xiàng)概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中遞送mRNA的載體系統(tǒng)靶向肝臟和心臟的效果明顯，但多在靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)上缺乏有效性。并且，以AAV為代表的載體系統(tǒng)通常會(huì)存在基因編輯工具尺寸的限制，特別是在胎兒個(gè)體中使用需要慎重考慮病毒免疫和載體整合風(fēng)險(xiǎn)。
非病毒載體遞送平臺(tái)LNPs可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)插入，避免隨機(jī)整合，從而提高基因藥物的安全性；在靶向遞送mRNA藥物的同時(shí)可以解決其短時(shí)間降解、反復(fù)給藥與表達(dá)閾值要求較高等問題。只要針對(duì)預(yù)期目標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)，就能發(fā)揮LNP的模塊化優(yōu)勢(shì)。
2021年，來自賓大研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種子宮內(nèi)mRNA脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)，在懷孕小鼠中驗(yàn)證了其篩選的LNP可安全實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)遞送mRNA，并善體內(nèi)胎盤mRNA的遞送效果。該研究為將來針對(duì)產(chǎn)前診斷出的遺傳性疾病開發(fā)新的潛在療法奠定了基礎(chǔ)，驗(yàn)證了通過臍靜脈注射遞送mRNA至圍產(chǎn)期小鼠胎兒肝臟、肺和腸道進(jìn)行基因編輯治療的可行性，但該研究還未驗(yàn)證其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的遞送效率。
LNP遞送mRNA進(jìn)行腦內(nèi)基因編輯新突破
今年7月，賓大研究團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行體內(nèi)LNP文庫篩選確定圍產(chǎn)期小鼠腦中表現(xiàn)最佳的LNP 的細(xì)胞取向后，針對(duì) LNP 配方進(jìn)行體外優(yōu)化，然后使用優(yōu)化的 LNP遞送胸腺嘌呤堿基編輯(ABE) mRNA和合成指導(dǎo)RNA（sgRNA），通過側(cè)腦室（ICV）注射方法在小鼠模型中糾正了IDUA的致病單基因突變，成功介導(dǎo)了LNP的靶向基因編輯治療和對(duì)遞送載體最小的免疫應(yīng)答。
▲ 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容導(dǎo)圖
在空白對(duì)照組的比對(duì)下，賓大團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的LNP載體不僅對(duì)大腦的靶向性良好，在心臟、肺、腸、肝、脾或腎中均無顯著的表達(dá)，而且無論哪種LNP在大腦內(nèi)均可觀察到相似的全腦分布：僅在腦室、鄰近星形膠質(zhì)細(xì)胞和對(duì)大腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)滲透有限的神經(jīng)元中的表達(dá)，且并不具備向腦室周圍間隙外的腦實(shí)質(zhì)深處擴(kuò)散的跡象。研究人員針對(duì)前階段實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)最好的C3 LNP進(jìn)行了參數(shù)上的進(jìn)一步優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，封裝的mRNA和sgRNA的比值為3:1時(shí)可獲得最好的基因編輯水平，但N:P值10:1上調(diào)至20:1時(shí)，雖然表現(xiàn)更好的腦神經(jīng)母細(xì)胞遞送效率，但毒性有所增強(qiáng)。
▲圍產(chǎn)期腦mRNA遞送LNP 文庫的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)
此外，該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步在食蟹猴胎兒和人類腦脊髓液(CSF)中驗(yàn)證了其優(yōu)化后LNP配方的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明：C3 LNPs的尺寸大小和多分散性均無顯著變化，穩(wěn)定性可維持一周；C3 LNPs的轉(zhuǎn)染效率較高，且對(duì)細(xì)胞的活力沒有顯著影響；C3 LNPs在圍產(chǎn)期胎兒大腦中的mRNA遞送效率，可轉(zhuǎn)化到更大的動(dòng)物模型中，并仍有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。
總結(jié)
單基因遺傳病作為只有一對(duì)等位基因控制的遺傳病，看似只改變了屬于2-3萬個(gè)組成的人類基因的基因之一，但表現(xiàn)出的結(jié)果卻是生命無法承受之重。對(duì)于進(jìn)行基因治療的研究來說，既有足夠簡單、精確的目標(biāo)，又對(duì)編輯技術(shù)的靶向性和準(zhǔn)確性提出了極高的要求。2023年7月，賓大研究團(tuán)隊(duì)還在Science發(fā)表了基于mRNA-LNP的造血干細(xì)胞基因編輯療法，克服了體外基因編輯造血干細(xì)胞療法的風(fēng)險(xiǎn)，使基因編輯療法如同打疫苗一樣簡單，也讓越來越多的罕見病患者看到了希望的曙光。
隨著2018年“基因編輯嬰兒”事件轟動(dòng)全球，基因編輯技術(shù)始終面臨著對(duì)倫理問題的質(zhì)疑。“轉(zhuǎn)基因”的安全未知性和后果不可控性，讓人們始終對(duì)于生命的尊嚴(yán)保持敬畏，也對(duì)過于激進(jìn)的基因療法表現(xiàn)天然地排斥。但只要不斷完善技術(shù)規(guī)范和遵守倫理的底線，在生命倫理的框架中進(jìn)行研究和進(jìn)步，合理利用基因編輯也確實(shí)可以有效的對(duì)部分醫(yī)學(xué)難題進(jìn)行有針對(duì)性的解決，化解某些人類不可控的原有危機(jī)，并對(duì)生命的奧秘實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的探索。
每一個(gè)罕見病的孩子都被看作是被上帝派來揭示基因秘密的“天使”，在新型藥物研制過程中，尤其是對(duì)于在孕婦，胎兒群體中使用的生物制品的安全性一定要進(jìn)行認(rèn)真的審視與監(jiān)督，在保障無嚴(yán)重不良反應(yīng)和影響的情況下加深對(duì)藥物及機(jī)制的了解。相信在基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展與靶向遞送技術(shù)的不斷優(yōu)化下，基于LNP遞送系統(tǒng)的基因編輯療法終將有一天會(huì)從小鼠實(shí)驗(yàn)邁向臨床，最終造福于那些被命運(yùn)選中的“天使”。
參考資料：
1.https://doi.org/10.1021/acsnano.3c02268
2.https://doi.org/10.1021/jacs.2c12893
3.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2835-2
4.https://doi.org/10.1126/science.adj0997