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National Science Review:高紹榮/劉文強(qiáng)/高帥揭開體細(xì)胞克隆胚胎圍著床期發(fā)育異常的“黑匣子”
發(fā)布日期:2023-08-18

來源:BioArt

作為迄今為止唯一一種能使體細(xì)胞獲得完整全能性的手段,體細(xì)胞核移植技術(shù)在生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用價值。在過去幾十年里,這項技術(shù)已在包括靈長類在內(nèi)的20多種哺乳動物物種上取得了成功,但由于體細(xì)胞重構(gòu)胚胎在重編程過程中存在多種表觀遺傳的障礙,導(dǎo)致克隆動物極低的出生率并伴隨出生胎兒及胎盤的發(fā)育缺陷【1】。近年來,許多研究人員嘗試通過修正克隆胚胎中異常建立的表觀修飾來改善核移植的成功率。同濟(jì)大學(xué)高紹榮及哈佛醫(yī)學(xué)院的張毅等研究團(tuán)隊,通過對核移植胚胎重編程過程中的機(jī)制進(jìn)行研究,鑒定出了在植入前胚胎發(fā)育過程中關(guān)鍵的組蛋白修飾(H3K9me3、H3K4me3和H3K9ac)異常所導(dǎo)致的重編程的壁壘,通過有效的干預(yù)手段可大幅提升核移植胚胎的植入前發(fā)育潛能【2-5】。另外,核移植胚胎Xist異常激活及H3K27me3依賴性印記基因的表達(dá)異??稍斐芍踩牒笈咛グl(fā)育的缺陷 【6,7】。通過基因編輯技術(shù)恢復(fù)它們的正常表達(dá)水平可提升克隆胚胎植入后發(fā)育能力及出生率【6,8】。

然而,現(xiàn)有的手段在大幅提升核移植技術(shù)的囊胚率和植入后發(fā)育能力的基礎(chǔ)上,其最終的出生率依然遠(yuǎn)低于正?;蝮w外受精胚胎。這意味著,還有許多其他未知的障礙限制了克隆胚胎發(fā)育的能力?;厮菡麄€核移植技術(shù)的發(fā)展歷程,絕大多數(shù)研究主要聚焦于植入前和后期克隆胚胎發(fā)育異常進(jìn)行探索。由于缺乏研究的手段和工具,目前對克隆胚胎圍著床階段的發(fā)育調(diào)控機(jī)制知之甚少。

2023年8月16日,同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院高紹榮和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)高帥課題組在National Science Review 在線發(fā)表了題為 Inhibition of Wnt activity improves peri-implantation development of somatic cell nuclear transfer embryos 的研究論文,該研究發(fā)現(xiàn)了一種新的導(dǎo)致圍著床期克隆胚胎發(fā)育失敗的表觀遺傳障礙:Wnt通路的異常激活。更重要的是,通過在培養(yǎng)液中添加Wnt通路抑制劑對Wnt信號通路進(jìn)行干預(yù)抑制(Wnti),可以顯著提高克隆胚胎圍著床期的發(fā)育能力并大幅提高克隆小鼠的出生率。

值得一提的是,高紹榮課題組同期發(fā)表的另一項工作中解釋了組蛋白修飾異常影響早期克隆胚胎的譜系建立(詳見BioArt報道:Nat Commun丨高紹榮/劉曉雨/李翀/江賜忠揭示異常H3K9me3重編程對克隆胚胎合子基因組激活和早期譜系分化的影響機(jī)制),提示了對克隆胚胎第一次譜系分化后圍著床期發(fā)育研究的重要性。然而圍著床期胚胎在母體子宮內(nèi)生長的不可觸及性,嚴(yán)重制約了對克隆胚胎圍著床期發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究。那么在這一階段克隆胚胎的形態(tài)學(xué)發(fā)生,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及表觀調(diào)控事件是如何進(jìn)行的?為了回答這一問題,高紹榮課題組優(yōu)化建立了3D胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)以應(yīng)用于克隆胚胎的體外培養(yǎng),這一系統(tǒng)可模擬體內(nèi)圍著床期發(fā)育過程,實(shí)現(xiàn)了克隆胚胎圍著床期發(fā)育的可視化。結(jié)合體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)的克隆囊胚在E4.5-E5.25階段出現(xiàn)發(fā)育阻滯,主要表現(xiàn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)向外胚層(epiblast, EPI)卵圓桶結(jié)構(gòu)(egg cyclinder)轉(zhuǎn)變時出現(xiàn)明顯異常。通過向克隆囊胚中補(bǔ)充同期體外受精胚胎的ICM細(xì)胞可極大程度地糾正外胚層形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變及胚胎的體內(nèi)植入率,而補(bǔ)充克隆胚胎的ICM細(xì)胞則對圍著床期胚胎發(fā)育沒有改善作用。

圖1:圍著床期克隆胚胎外胚層異常形態(tài)學(xué)發(fā)生過程

為了驗(yàn)證EPI發(fā)育異常的分子機(jī)制,研究人員分別對圍著床期體外培養(yǎng)的胚胎及體內(nèi)胚胎進(jìn)行大量/單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果表明,克隆胚胎的EPI相較于體外受精胚胎,其多能性狀態(tài)(Naïve-Primed)的轉(zhuǎn)變受阻,并且這種異常現(xiàn)象普遍存在于不同供體細(xì)胞(顆粒細(xì)胞,支持細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞)來源克隆胚胎的圍著床期發(fā)育過程。進(jìn)一步的微量組蛋白ChIP-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的多能性基因啟動子區(qū)分布的H3K27me3重塑也出現(xiàn)異常。
為了尋找多能性轉(zhuǎn)變異常的原因,研究人員分別進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組、報告系統(tǒng)及信號通路干預(yù)等實(shí)驗(yàn),明確了Wnt通路的持續(xù)異常激活是阻礙克隆胚胎EPI細(xì)胞多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變的重要障礙。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了許多Wnt通路拮抗因子,如Dkk1、Tcf7l1等基因的表達(dá)在植入前囊胚階段即受到顯著抑制。通過對小鼠供體細(xì)胞和早期胚胎組蛋白修飾的公共數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞中攜帶的H3K27me3可能是導(dǎo)致著床階段Dkk1等Wnt通路拮抗基因表達(dá)抑制的根源。

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圖2:圍著床期克隆胚胎外胚層Wnt通路異常激活及干預(yù)作用

緊接著,為了驗(yàn)證抑制圍著床期階段Wnt通路持續(xù)激活對胚胎發(fā)育的改善作用,研究人員在培養(yǎng)液中添加了Wnt通路抑制劑IWP2/IWR1-endo對克隆囊胚進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)Wnt通路抑制劑可顯著促進(jìn)克隆胚胎圍著床期的譜系發(fā)育軌跡、EPI形態(tài)學(xué)發(fā)生、表觀狀態(tài)及多能性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。重要的是,Wnt通路抑制劑處理的克隆囊胚在子宮移植后,可顯著提升胚胎著床能力以及出生率(顆粒細(xì)胞供體的核移植胚胎出生率從0.72%提高到5.55-7.04%;支持細(xì)胞供體的核移植胚胎出生率從0%提高到10.3%)。最后,研究人員通過聯(lián)合使用過去已報道的重要表觀修復(fù)手段,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合Xist KO和Dnmt3a/b干擾可進(jìn)一步將核移植囊胚的出生率提升至20%以上。

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圖3:圍著床期克隆胚胎發(fā)育異常的障礙機(jī)制

總的來說,該研究利用優(yōu)化的囊胚模擬著床培養(yǎng)系統(tǒng)首次揭開了克隆胚胎圍著床期的動態(tài)發(fā)育過程,揭示了該時期外胚層形態(tài)學(xué)發(fā)生及多能性轉(zhuǎn)變異常的生物學(xué)事件。重要的是,研究人員發(fā)現(xiàn)了Wnt通路的持續(xù)激活是影響克隆胚胎圍著床期發(fā)育的一個重要障礙,通過小分子抑制劑干預(yù)Wnt激活及聯(lián)用其他表觀修復(fù)手段能進(jìn)一步提升核移植效率。本項研究為理解圍著床期胚胎發(fā)育,拓展克隆技術(shù)在發(fā)育生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)及畜牧繁殖業(yè)的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

同濟(jì)大學(xué)李延鶴博士和北京基因組研究所鄭彩宏副研究員為本研究的共同第一作者。同濟(jì)大學(xué)高紹榮教授、劉文強(qiáng)教授和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)高帥教授為共同通訊作者。

原文鏈接:https://doi.org/10.1093/nsr/nwad173

參考文獻(xiàn):

1、Matoba, S. and Y. Zhang, Somatic Cell Nuclear Transfer Reprogramming: Mechanisms and Applications. Cell Stem Cell, 2018.

2、Liu, W., et al., Identification of key factors conquering developmental arrest of somatic cell cloned embryos by combining embryo biopsy and single-cell sequencing. Cell Discov, 2016. 2: p. 16010.

3、Matoba, S., et al., Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell, 2014. 159(4): p. 884-95.

4、Yang, G., et al., Dux-Mediated Corrections of Aberrant H3K9ac during 2-Cell Genome Activation Optimize Efficiency of Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell Stem Cell, 2020.

5、Gao, R., et al., Inhibition of Aberrant DNA Re-methylation Improves Post-implantation Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos. Cell Stem Cell, 2018. 23(3): p. 426-435 e5.

6、Inoue, K., et al., Impeding Xist expression from the active X chromosome improves mouse somatic cell nuclear transfer. Science, 2010. 330(6003): p. 496-9.

7、Matoba, S., et al., Loss of H3K27me3 Imprinting in Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos Disrupts Post-Implantation Development. Cell Stem Cell, 2018. 23(3): p. 343-354 e5.

8、Wang, L.Y., et al., Overcoming Intrinsic H3K27me3 Imprinting Barriers Improves Post-implantation Development after Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell Stem Cell, 2020. 27(2): p. 315-325 e5.

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