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來源：BioArtMED
人類內耳是自然界中最精密的器官之一，以螺旋狀耳蝸為特點，它由一系列有序的聽覺感覺細胞，以及復雜的前庭器官組成。內耳的復雜形態(tài)是在胎兒發(fā)育期由一系列錯綜復雜的信號事件組成的，具有高度協(xié)調且高保真性。目前全世界有近10%的成年人有中度到嚴重的聽力損失，但出生時的聽力損失發(fā)生率只有不到0.2%。這意味著絕大多數(shù)的神經(jīng)性聽力損失是由成體發(fā)育中的原始內耳細胞功能障礙造成的。隨著耳機等音樂設備的出現(xiàn)，越來越多成年人出現(xiàn)更為嚴重的中度至重度聽力損失。
耳解剖結構，來源：Unity asset store
聽覺功能下降是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，WHO的數(shù)據(jù),全世界有4.6億人受到聽力下降的影響，其中90%以上的人群屬于低收入和中等收入國家。在65歲的老年人中，有30%以上的人受到聽力損傷的影響。此外，每年有超過100萬新生兒出生時存在聽力功能障礙，超過1.4億青少年（12-35歲）由于長時間使用耳機而暴露于高音量的音樂和娛樂活動中，受到聽力損傷的影響。這些數(shù)據(jù)表明，聽力受損已經(jīng)成為全世界范圍內的一個常見的公共衛(wèi)生問題，需要我們采取行動來進行改善。近年來，隨著研究的深入，干細胞在多個疾病的研究和治療領域中展現(xiàn)出了不錯的前景。同樣，在聽覺治療的研究領域也取得了許多新的進展。
為了在體外重現(xiàn)人類內耳發(fā)育的復雜過程，2023年7月6日，美國印第安納大學Eri Hashino研究組在Cell Stem Cell發(fā)表題為“Generating high-fidelity cochlear organoids from human pluripotent stem cells”的研究論文，通過人類誘導多能干細胞建立了高保真性耳蝸類器官。
耳蝸中的機械敏感毛細胞負責聽力，但是容易受到基因突變和環(huán)境損傷。由于人類耳蝸組織研究樣本的缺乏，對人類耳蝸組織以及其中毛細胞的研究變得非常困難。類器官的出現(xiàn)則為耳蝸組織的研究提供了重要平臺。
為了監(jiān)測體外培養(yǎng)中人類誘導多能干細胞衍生耳蝸祖細胞和毛細胞的效率，作者們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了PAX2-2A-nGFP/POU4F3-2A-ntdTomato的雙色報告因子。PAX2 是耳蝸祖細胞早期標記物，而POU4F3則是高度特異性的分化毛細胞標記物，可以用于確定耳蝸類器官培養(yǎng)效率（圖1）。
圖1 表達PAX2-2A-nGFP/POU4F3-2A-ntdTomato雙色報告因子的耳蝸類器官
研究團隊所建立類器官的平臺一定程度上依賴人類誘導多能干細胞的自我誘導分化，與之前報道的內耳類器官實驗方案類似 [3-6]。為了進一步優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)從而可以持續(xù)產(chǎn)生毛細胞以及前庭表型，作者們對耳蝸組織發(fā)育中的關鍵因子進行分析。Sonic Hedgehog（SHH）以及WNT信號通路在耳蝸結構的發(fā)育中發(fā)揮了關鍵作用。因此，研究團隊在誘導方案中順序加入小分子SHH激動劑PUR以及WNT抑制劑IWP2，結果發(fā)現(xiàn)能夠促進內耳類器官的腹側化（圖2）。
圖2 優(yōu)化耳蝸類器官實驗方案
隨后，研究團隊對內耳類器官進行單細胞RNA測序，總共收集了37073個細胞，對耳蝸細胞標記物進行分析并確定了誘導培養(yǎng)方案的有效性。研究發(fā)現(xiàn)，PUR+IWP2的處理會促進人內耳類器官耳祖細胞的腹側化。另外，通過標記物的免疫染色，研究團隊發(fā)現(xiàn)腹側化的內耳類器官中表達毛細胞標記物。掃描電鏡的結果也表明所建立耳蝸類器官表現(xiàn)出毛細胞的結構特征，電生理學的研究也發(fā)現(xiàn)類器官表達外毛細胞標記物PRESTIN且具有耳蝸外毛細胞特有的電壓門控電流特征。
圖3 耳蝸類器官工作模型
科學家利用iPSCs的3D培養(yǎng)技術,嘗試尋找耳蝸復制的關鍵分化線索。研究者發(fā)現(xiàn)wnt信號轉導促進了基因在生物祖細胞中的表達。隨后,腦室化的祖細胞分化成上皮細胞，其形態(tài)、標記表達和功能特性與耳蝸內和外毛細胞一致。這些結果表明iPSCs分化的祖細胞足以推動耳蝸感應器官的發(fā)育,并建立一個前所未有的系統(tǒng)來重建人的聽覺器官。
研究者已經(jīng)證明了SH和Wnt通路的精確的時間調節(jié)性賦予了腹側耳型的多能性祖細胞,其中一些隨后產(chǎn)生了具有結構性、轉錄性和功能性兩種類型的耳蝸毛細胞，內、外毛細胞和成熟的毛細胞。體外培養(yǎng)的器官可以完全進入類同于人類胎兒發(fā)育第三個月的階段。此外，SCRA-SEQ分析確定NR2F1是一個以前未被識別的關鍵轉錄途徑，對耳蝸和前庭多樣化必不可少。需要進一步的研究來闡明轉錄途徑和結構發(fā)育之間交叉對話的機制,并建立一種控制內毛細胞和外毛細胞生成的方法。研究者在研究中所建立的耳蝸器官被認為是一個強大的人類模型,可應用于研究人類耳蝸發(fā)育的生物學，闡明遺傳性聽力喪失的發(fā)病機制，并確定治療深度聽力喪失的治療靶點。
雖然當前干細胞治療聽力下降尚處于基礎研究階段，但隨著更多研究項目的進一步推進，越來越多的有意義的數(shù)據(jù)在不斷累積當中，相信在不久的將來，我們可以通過批量培育的人類耳蝸實現(xiàn)更加可靠的治療，幫千萬病患摘掉助聽器，重回充滿歡聲笑語的正常生活。
總的來說，作者通過復制耳蝸組織發(fā)育的關鍵分化線索，通過順序調節(jié)Sonic Hedgehog和WNT信號通路優(yōu)化耳蝸類器官的誘導方案，促使耳蝸類器官中發(fā)育出形態(tài)各異的毛細胞并且具有標記物表達、結構特征以及電生理特征，實現(xiàn)了人類聽覺系統(tǒng)的全面模擬，為內耳發(fā)育以及病理學研究提供了重要工具平臺。