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來源：浙江大學基礎醫(yī)學院
核仁是多種液相凝聚物，存在液-液相分離（LLPS）現(xiàn)象，典型的核仁是一個三層區(qū)室化的結構，許多蛋白都定位于此并參與構建纖維中心（FC）、致密纖維組分（DFC）和顆粒組分（GC）液相分層。核仁相分離是核糖體生物發(fā)生，蛋白質的翻譯和核仁應激反應所必需的至關重要的分子事件。然而，其在多能干細胞命運決定過程中的作用尚不清楚。LIN28A是一種高度保守的RNA結合蛋白，在促進體細胞重編程和多能性狀態(tài)轉變過程中發(fā)揮重要作用。細胞質中的LIN28A抑制let-7 microRNA的成熟在過去被廣泛研究，但很少有研究關注LIN28A在細胞核中的作用。
2024年2月10日，浙江大學基礎醫(yī)學院干細胞與再生醫(yī)學中心/浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院/良渚實驗室張進課題組，浙江大學基礎醫(yī)學院/浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院馮鈺課題組在Nature Communications雜志上發(fā)表題為“Dynamic nucleolar phase separation influenced by non-canonical function of LIN28A instructs pluripotent stem cell fate Decisions”的研究論文，本研究利用多種分子生物學實驗首次發(fā)現(xiàn)LIN28A可以作為一個核仁完整性的標志蛋白，LIN28A的非經(jīng)典相分離功能可以調控重編程，和帕金森癥相關聯(lián)的LIN28A IDR突變對核仁相變有重要作用。該研究與張進課題組在2021年7月31日Protein & Cell雜志上發(fā)表的題為“LIN28 Coordinately Promotes Nucleolar/Ribosomal Functions and Represses the 2C-like Transcriptional Program in Pluripotent Stem Cells”的研究論文以及2021年11月4日在Nature Communications雜志上發(fā)表題為“rRNA Biogenesis Regulates Mouse 2C-like State by 3D Structure Reorganization of Peri-Nucleolar Heterochromatin”的研究論文密切相關,并進一步從核仁應激和相分離角度，對核仁參與調控多能干細胞的命運決定的機制做出了更加深入的闡釋。
首先，研究人員構建了eGFP-LIN28A敲入的小鼠胚胎干細胞E14細胞系和eGFP-LIN28A過表達小鼠胚胎干細胞E14細胞系。觀察到LIN28A分布在細胞質和核仁, LIN28A與核仁顆粒組分（GC）層的NPM蛋白共定位，并包裹致密纖維組分（DFC）層的蛋白FBL。這說明核仁中的LIN28A蛋白可以作為核仁的標志物。同時，核仁中的LIN28A對相分離抑制劑1，6-己二醇（HEX）處理敏感， 1%HEX處理導致LIN28A凝集物在核仁內的面積明顯擴張彌散，單位面積內熒光強度顯著減弱, 半徑形狀指數(shù)公式計算得到LIN28A形狀的不規(guī)則度也顯著增加（圖1）。
圖1 LIN28A在小鼠胚胎干細胞E14中的定位
在小鼠胚胎干細胞中，LIN28A的RNA結合結構域（RBD）和內在無序區(qū)（IDRs）是核仁相分離所必需的。LIN28A蛋白有五個主要結構域:N端序列（氨基酸1-38），使用常用的內在無序區(qū)評估網(wǎng)站PONDR（http://pondr.com/），預測N端序列為內在無序的區(qū)域（IDR1）；一個冷休克結構域（CSD）和一個鋅指結構域（ZFD），這兩個結構域已被證明可以結合RNA，是典型的RNA結合區(qū)域；CSD和ZFD之間的柔性連接區(qū)域（Linker，氨基酸113-136），被預測為內在無序的區(qū)域，將其命名為IDR2；還有C端（氨基酸177-209）也被預測為無序區(qū)域，將其命名為IDR3。
為了確定LIN28A的單個結構域對核仁液-液相分離的貢獻，研究人員構建了N端，C端，N+C端，CSD（氨基酸39-112）和ZFD（氨基酸137-176）單結構域缺失的截短體質粒。接著利用CRISPR/CAS9技術得到Lin28a敲除小鼠胚胎干細胞E14的單克隆，而后在Lin28a敲除細胞系中穩(wěn)定表達FBL-mCherry或者NCL-eGFP融合蛋白，然后將對應的與eGFP， mCherry融合的截短體LIN28A表達到已經(jīng)穩(wěn)定表達FBL-mCherry融合蛋白的Lin28a敲除細胞系中。
實驗結果發(fā)現(xiàn)，Lin28a敲除導致核仁被破壞，表現(xiàn)為FBL由野生型的環(huán)狀變?yōu)閺浬⒌臓顟B(tài)。過表達全長LIN28A可以挽救FBL形態(tài)異常，使FBL和NCL重新恢復環(huán)狀。LIN28A的 N端序列（IDR1）缺失，C端序列（IDR3）缺失或N，C兩端序列同時缺失的截短體并不能拯救LIN28A敲除導致的核仁損傷，F(xiàn)BL仍然表現(xiàn)為異常的彌漫狀態(tài)。CSD或ZFD的缺失嚴重破壞了LIN28A核仁定位和FBL環(huán)狀形態(tài)，且LIN28A和FBL在核仁中的共定位異常。簡而言之，當LIN28A的IDR或RBD被截斷時，DFC層核仁蛋白FBL失去了它的“環(huán)”結構，這提示核仁相分離分層異常。對幾種截短體細胞系中核仁蛋白FBL典型形態(tài)進行量化統(tǒng)計表明LIN28A的RNA結合區(qū)和內在無序區(qū)是維持核仁正常相分離所必需的。
此外，研究人員檢測了FBL在以上幾種LIN28A細胞系中的流動性，發(fā)現(xiàn)過表達全長LIN28A可以挽救Lin28a敲除導致的FBL流動性減弱的現(xiàn)象，而FBL在截短的LIN28A細胞系中都表現(xiàn)出相對較低的流動性。這一結果也從流動性的角度印證了LIN28A的RNA結合區(qū)和內在無序區(qū)是維持核仁正常相分離所必需的。
接下來，在體外實驗中，研究人員純化了全長和幾種截短體LIN28A重組蛋白，發(fā)現(xiàn)只有全長的LIN28A蛋白可以形成液滴，任何IDR和RNA結合結構域的缺失都會消除LIN28A液-液相分離形成液滴的能力。LIN28A 的N端序列缺失，CSD和ZFD之間的柔性連接區(qū)域缺失，C端序列缺失這三種IDR缺失情況會使蛋白形成不規(guī)則聚集體。
綜上所述，LIN28A的IDR和RNA結合結構域對于形成LIN28A本身的相分離以及促進核仁蛋白相分離至關重要（圖2）。
圖2 LIN28A的RNA結合結構域和IDRs是核仁相分離所必需的
IDRs的關鍵氨基酸對LIN28A和核仁相分離至關重要。上述的實驗證明了RNA結合結構域和內在無序區(qū)對LIN28A和核仁的相分離至關重要?？梢园l(fā)生液-液相分離的蛋白的特點是IDR序列的存在。IDR區(qū)域富含少數(shù)氨基酸的重復序列，通常是低復雜度的區(qū)域, 不折疊成一個固定的三維結構。RNA結合域已經(jīng)在LIN28A功能的背景下進行了深入研究。作者更好奇IDR區(qū)域的功能,這是以前在LIN28A的研究中沒有被關注到的。接下來，研究人員進一步將研究范圍精確到到賦予IDR相分離特性所必需的關鍵氨基酸?？杀涣姿峄腟120, S200絲氨酸殘基，以及與帕金森病相關的R192精氨酸殘基，三者都在LIN28A的IDR區(qū)域中，并且這三個氨基酸在人和小鼠之間保守。一些研究表明，絲氨酸磷酸化和精氨酸通過改變蛋白所帶電荷影響相分離。為了進一步了解這些氨基酸在LIN28A相分離中的作用，用丙氨酸取代絲氨酸，構建了模擬去磷酸化的 S120A和S200A 雙氨基酸突變的LIN28A突變體，命名為Mut LIN28A，并將該突變體穩(wěn)定表達于Lin28a敲除的E14細胞系。FRAP實驗結果表明，Mut LIN28A在核仁內的流動性減弱，并且導致核仁蛋白FBL流動性減弱。
而后，研究人員分別構建了模擬去磷酸化S120A LIN28A單個氨基酸突變體和模擬去磷酸化S200A LIN28A單個氨基酸突變體。FRAP分析顯示，兩個模擬去磷酸化的單個氨基酸突變體LIN28A蛋白都表現(xiàn)出較低的流動性，同時FBL在核仁中的流動性較低。
最近,功能喪失突變體R192G LIN28A在兩個早發(fā)性帕金森病的病人中被發(fā)現(xiàn), 據(jù)報道，野生型LIN28A過表達可促進培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在帕金森病模型中的治療潛力，但在相分離領域里沒有已知的機制解析突變導致的發(fā)育缺陷和中腦多巴胺神經(jīng)元相關表型。FRAP分析顯示，R192G單突變的LIN28A蛋白在核仁中的流動性較低，F(xiàn)BL蛋白也是如此。所有突變體在細胞質中的流動性不受影響。
為了進一步確認LIN28A突變體對核仁破壞作用是由于其相分離特性減弱所致，通過融合外源的FUS IDR (S120A-FUS IDR, S200A-FUS IDR, R192G-FUS IDR)來構建挽救性的LIN28A突變體， FUS IDR被公認可以驅動相分離。值得注意的是，融合的IDR恢復了LIN28A突變體的形態(tài)和相分離能力。
綜上所述，IDR區(qū)域的關鍵氨基酸對于LIN28A相分離以及維持正常的核仁相分離是必需的（圖3）。
圖3 IDRs的關鍵氨基酸對LIN28A和核仁相分離至關重要
LIN28A維持的核仁相分離對小鼠胚胎干細胞從naive到primed多能性轉化至關重要。與在LIF/2i培養(yǎng)條件中相比，F(xiàn)GF2/Activin A培養(yǎng)基培養(yǎng)的野生型mESCs表達較高的primed狀態(tài)標志基因Otx2，F(xiàn)gf5和Lin28a，較低的naïve狀態(tài)標記基因Klf4、Nanog和Esrrb。在FGF2/Activin A培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Lin28a敲除的mESCs，相對于野生型mESCs，表現(xiàn)出naïve狀態(tài)相關基因Nanog，Klf4的持續(xù)高水平表達。在Lin28a敲除細胞中過表達全長野生型(WT) LIN28A時，F(xiàn)GF2/Activin A培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞恢復了向primed狀態(tài)轉換的能力。這說明LIN28A可以促進mESCs從naive到primed多能性轉化。
在Lin28a敲除細胞中過表達磷酸化缺失的LIN28A突變體(Mut LIN28A)時，NANOG免疫染色和熒光強度統(tǒng)計分析顯示Mut LIN28A突變體細胞在FGF2/Activin A培養(yǎng)基中Nanog基因仍然持續(xù)高水平表達，傾向于維持naïve狀態(tài)。磷酸化缺失的LIN28A (S120A和S200A)不能促進ESC從naïve狀態(tài)退出，進入primed狀態(tài)。S120A, S200A和R192G三個單氨基酸突變體LIN28A也都失去了促進mESCs從naïve狀態(tài)退出，進入primed的功能，但是三種突變體與FUS IDR融合后，在FGF2/Activin A培養(yǎng)基中NANOG熒光減弱，mESCs可以順利的進入primed狀態(tài)。以上結果表明，LIN28A相分離對小鼠胚胎干細胞從naive到primed多能性轉化至關重要。
STED超高分辨率成像顯示，F(xiàn)BL在primed狀態(tài)的野生型mESCs中形成了較大的典型的“環(huán)”結構，表明primed狀態(tài)下的DFC單元更發(fā)達。LIN28A的缺失會導致FBL環(huán)狀結構不明顯，NPM形態(tài)異常，F(xiàn)BL不能浸潤在NPM的小孔中，核仁分層紊亂。這種異常的FBL形態(tài)和核仁分層在從naive狀態(tài)到primed狀態(tài)的轉換過程中沒有改善。以上結果說明從naive狀態(tài)到primed狀態(tài)的轉換過程中，LIN28A幫助核仁正確分層，維持核仁正常相分離。
綜上所述，在naïve多能性狀態(tài)向primed多能性狀態(tài)轉換期間，核仁的形態(tài)和功能變得更加成熟。LIN28A介導的相分離在核仁重構過程和隨后的細胞命運的決定中發(fā)揮重要作用（圖4）。
圖4 LIN28A維持的核仁相分離對小鼠胚胎干細胞從naive到primed多能性轉化至關重要
LIN28A相分離對體細胞重編程至關重要。因此，研究人員想知道LIN28A在核仁中的相分離是否會影響重編程的效率。在小鼠體細胞重編程實驗中，LIN28A IDR區(qū)單個氨基酸突變導致重編程效率降低。FUS IDR融合后的LIN28A突變體挽救了降低的重編程效率，其具備與野生型相似的重編程效率。
作者進一步鑒定了小鼠的MEF細胞和iPSCs的核仁狀態(tài)，STED成像顯示MEF細胞和小鼠iPSCs之間核仁的形態(tài)和分層存在顯著差異。在MEF細胞中，NPM呈不規(guī)則形狀; 而在iPSCs中，NPM呈圓形帶小孔的“蓮藕”結構，并與LIN28A共定位。使用半徑指數(shù)公式 (Boyce-Clark semidiameter index)來量化GC層形狀的規(guī)律性。與MEF細胞相比，在iPSCs中，GC層形態(tài)顯示更高程度的規(guī)則性。
綜上所述，在小鼠體細胞重編程的研究背景下， IDR區(qū)域介導的LIN28A相分離對小鼠體細胞重編程過程中的核仁重塑至關重要，并關系著重編程的效率。重編程的過程也是核仁分層變得清晰的過程（圖5）。
圖5 LIN28A相分離對體細胞重編程至關重要
綜上所述，該研究明確了LIN28A幫助完善核仁分層，這在小鼠胚胎干細胞從naive到primed多能性轉化過程中起到促進作用；以及在重編程體系中LIN28A相分離對核仁重塑，進而促進重編程的作用（圖6）。
圖6 LIN28A相分離在維持核仁完整性和決定細胞命運中的作用模型