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來源：GK綠鑰生物科技
埃爾朗根大學(xué)Felix B Engel教授在《Advanced materials》上發(fā)表論文“Direct 3D-Bioprinting of hiPSC-Derived Cardiomyocytes to Generate Functional Cardiac Tissues”，他們提出一種直接3D生物打印方法，將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的心肌細(xì)胞嵌入膠原透明質(zhì)酸墨水中，以準(zhǔn)確和可重復(fù)的方式產(chǎn)生厘米大小的功能性環(huán)和心室形狀的心臟組織，最終，打印物能夠表現(xiàn)出類似心臟的功能，能培養(yǎng)至少100天并對(duì)藥物刺激做出反應(yīng)。
WHAT——什么是hiPSC來源的心肌細(xì)胞？
hiPSC來源的心肌細(xì)胞是由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）分化而來的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs），能表現(xiàn)出收縮和響應(yīng)電信號(hào)等特性。hiPSC來源的心肌細(xì)胞具有潛在的重要應(yīng)用價(jià)值，尤其在心臟疾病治療和研究方面，可用于疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)、個(gè)性化醫(yī)療等應(yīng)用。
WHY——為什么用直接生物3D打印方法來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)？
生物制造的一個(gè)目標(biāo)是設(shè)計(jì)組織、器官其一部分來研究或治療當(dāng)前治療方法有限的疾病。目前主要用的生物制造方法，一種是無細(xì)胞3D支架，但有一個(gè)主要缺點(diǎn)是難以將細(xì)胞定殖，特別是以有組織的方式定殖。另一種方法是鑄造含有細(xì)胞的水凝膠，然而這種方法不允許制造層次結(jié)構(gòu)。目前，3D生物打印技術(shù)有希望解決傳統(tǒng)生物制造面臨的主要瓶頸和當(dāng)前問題，3D生物打印能保證細(xì)胞在整個(gè)構(gòu)建過程中均勻分布，能直接制造具有生理功能的組織，允許制造傳統(tǒng)方法難以實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)，能根據(jù)具體需求定制個(gè)性化組織結(jié)構(gòu)。
HOW——作者使用了一種三步雙組分方案，通過復(fù)雜凝聚方式生產(chǎn)明膠/阿拉伯膠微粒。
圖1 壓實(shí)后的微粒表現(xiàn)出剪切變薄和自愈的特性
微粒以圓形為主，部分呈橢圓形，通過離心壓實(shí)時(shí)，微粒形成具有自愈特性的支撐浴，允許打印噴嘴自由通過。即使倒置容器，支撐浴中的染料也能保持在原位。為證實(shí)這些觀察現(xiàn)象，作者進(jìn)行了流變分析。結(jié)果表明在測(cè)試的整個(gè)頻率范圍內(nèi)，支撐浴在低應(yīng)變下表現(xiàn)出固體樣流變行為以及剪切稀化行為，在交替剪切速率下，支撐浴表現(xiàn)出近乎瞬時(shí)和完全的恢復(fù)行為。綜合來說，作者開發(fā)出一種簡單的方法來生產(chǎn)具有自修復(fù)特性的支撐浴，可用于凝膠打印。
圖2 膠原蛋白/透明質(zhì)酸油墨使打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定
作者用不同濃度的膠原墨水打印脫細(xì)胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)評(píng)估膠原蛋白在上述支撐浴中的可打印性，此外，還添加透明質(zhì)酸(HA)到膠原蛋白中，以改善生物墨水的可打印性。為了確定打印環(huán)的均勻性和打印過程的可重復(fù)性，團(tuán)隊(duì)從多個(gè)打印環(huán)的圖像生成重疊圖來評(píng)估。隨著膠原蛋白含量的增加，重疊圖顯示出更均勻的打印環(huán)，邊界更光滑。此外，隨著膠原濃度的增加和透明質(zhì)酸的加入，強(qiáng)度譜顯示出更小的差異，變得更加明確。作者最終選擇了由3.0 mg/ml膠原-i和3.0 mg/ml HA (CollHA3-3)組成的生物鏈進(jìn)行進(jìn)一步的研究，該數(shù)據(jù)擁有最高的再現(xiàn)性以及對(duì)擠出速度的最佳控制，且打印出的環(huán)結(jié)構(gòu)壁厚較薄。
圖3 打印hipsc衍生的心肌細(xì)胞形成功能性心臟組織
為了產(chǎn)生有層次結(jié)構(gòu)的組織或器官，控制細(xì)胞分布很重要。為了評(píng)估細(xì)胞的添加是否會(huì)影響墨水的可打印性，作者將25 Mio/ml hiPSC-CMs加入到CollHA3-3墨水中，用于打印環(huán)狀組織。結(jié)果表明打印環(huán)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并表現(xiàn)出良好的均勻性。在組織構(gòu)建后(第0天)和制造后7天（第7天)對(duì)打印的組織和滴鑄形成的組織進(jìn)行染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在任何時(shí)間點(diǎn)，鑄型組織和打印組織的活力無顯著差異。而第30天，打印的hiPSC-CMs顯示出典型的肌合成α-肌動(dòng)蛋白條紋，以及緩慢的骨骼肌鈣蛋白-i (ssTnI)和心臟肌鈣蛋白-i (cTnI)。45個(gè)打印組織中在第3天已經(jīng)表現(xiàn)出了自發(fā)的同心收縮。通過Fluo-4熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)和減弱反映了打印組織在收縮周期中表現(xiàn)出鈣的同步流入和流出。測(cè)量不同區(qū)域的熒光強(qiáng)度可以識(shí)別出起搏中心，其行為隨著時(shí)間的推移顯示出高同步性，遠(yuǎn)處區(qū)域達(dá)到熒光強(qiáng)度峰值的延遲約為100 ms(1幀)。這進(jìn)一步證明了hiPSC-CMs在打印組織內(nèi)形成了相互連接的網(wǎng)絡(luò)。
圖4 打印的心臟組織對(duì)被動(dòng)阻力施加同心力
為了檢驗(yàn)打印環(huán)是否可以施加類似于心臟的同心圓力，作者設(shè)計(jì)并制造了由六個(gè)柔性柱組成的陣列。第1天將打印的環(huán)轉(zhuǎn)移到柱陣列上，并在柱子周圍壓實(shí)，培養(yǎng)至第30天在收縮周期中，打印的環(huán)能夠同步使所有6根柱子偏移，這說明它們能夠?qū)ψ枇κ┘宇愃频耐膱A力。
圖5 3D生物打印功能心室模型
作者設(shè)計(jì)并打印了一個(gè)高度為14 mm，最寬處直徑為8 mm的心室模型，測(cè)試他們的方法是否能夠?qū)崿F(xiàn)人類心臟心室功能模型的3D生物打印。打印心室在制造7天后，形態(tài)穩(wěn)定不變并發(fā)生了自發(fā)的同步收縮，表達(dá)出了與心室功能相關(guān)的產(chǎn)物。最后作者通過實(shí)驗(yàn)表示打印模型的培養(yǎng)時(shí)間至少可以達(dá)到100天。有希望在未來打印并培養(yǎng)出可用于人類使用的人工3D生物打印培養(yǎng)心臟心室。
總結(jié)：作者實(shí)現(xiàn)了直接打印嵌入膠原基生物墨水的hiPSC-CMs來生成功能性心臟組織。以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)論均支持這一結(jié)論。1、嵌入膠原/HA墨水中的hiPSC-CMs可以精確且可重復(fù)地3D生物打印成環(huán)形和心室形狀的心臟組織，并形成相互連接的網(wǎng)絡(luò)；2、打印的組織表現(xiàn)出持續(xù)數(shù)月的自發(fā)和同步收縮，這些收縮可以通過藥物刺激來調(diào)節(jié)頻率；3、打印組織能夠?qū)贡粍?dòng)阻力收縮。作者的方法為制造先進(jìn)的藥物篩選模型、組織移植，甚至未來可能用于器官移植的工程心臟提供思路。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.20230591