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2024年7月27日，廣州實驗室/廣州醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院徐濤/劉會生課題組于Nature communications雜志在線發(fā)表題為"Directed differentiation of pancreatic δ cells from human pluripotent stem cells"的文章。
該研究文章利用人多能干細胞作為起始材料，在發(fā)育的后前腸期至胰腺內(nèi)胚層階段，通過聯(lián)合應(yīng)用成纖維生長因子FGF7和FGF2，實現(xiàn)了對胰腺譜系細胞(特別是內(nèi)分泌前體細胞)的高度分化維持。此方法通過激活δ細胞轉(zhuǎn)錄因子，促進人多能干細胞向δ細胞的高效定向分化。這一過程為再生醫(yī)學和細胞治療提供了一種潛在的δ細胞來源，有助于糖尿病等代謝性疾病的治療研究。
人胰島主要由α、β、δ三種內(nèi)分泌細胞組成，分別分泌胰高血糖素(GLUCAGON, GCG)、胰島素(INSULIN, INS)、生長抑素(SOMATOSTATIN, SST)。過往的研究大量集中在α和β細胞對血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用及其導致糖尿病的機制。近期的研究證據(jù)表明δ細胞在調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮重要功能。它能抑制α、β細胞GCG和INS的釋放，并可通過旁分泌信號通路參與決定體內(nèi)血糖設(shè)定點。臨床上也發(fā)現(xiàn)δ細胞功能的缺失引起胰島功能障礙和血糖失調(diào)。因此，δ細胞也逐漸成為受關(guān)注的糖尿病治療潛在靶點。然而，δ細胞在人胰島中僅占5%左右，其分離純化困難，造成資源短缺，為研究δ細胞生理功能和藥物研發(fā)帶來巨大挑戰(zhàn)。
人多能干細胞衍生的功能性胰島α、β細胞已被證實可為基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化研究提供重要細胞資源并加速研究和轉(zhuǎn)化的進程。但至今尚未有δ細胞的定向分化的方法。本研究基于β細胞和δ細胞發(fā)育軌跡的相似性，成功建立了一種由人多能干細胞高效定向分化為功能性胰島δ細胞的方法，為δ細胞基礎(chǔ)研究及糖尿病藥物篩選提供重要資源。
本方法以人多能干細胞(human Pluripotent stem cell, hPSCs)為基礎(chǔ)利用小分子誘導經(jīng)歷內(nèi)胚層(Definitive Endoderm, DE)，原腸管(Primitive Gut Tube, PGT)，后前腸期(Posterior Foregut, PF)，胰腺內(nèi)胚層(Pancreatic Endoderm, PE)，內(nèi)分泌前體細胞(Endocrine Precursor, EP)，未成熟胰腺細胞(Immature Endocrine Cell, IEC)，成熟胰腺細胞(Mature Endocrine Cell, MEC)等時期，最終高效分化功能成熟的胰島δ細胞。
研究過程
研究團隊發(fā)現(xiàn)在后前腸期向胰腺內(nèi)胚層分化階段， FGF7濃度依賴性地增強胰腺前體細胞的分化效率；而延長FGF7的作用時間(胰腺內(nèi)胚層-內(nèi)分泌前體細胞)可以進一步增強內(nèi)分泌前體細胞的分化效率。在相同分化階段加入FGFR1的特異性激活配體FGF2,能夠提升內(nèi)分泌前體細胞的分化效率并特異性地促進δ細胞分化同時抑制α、β細胞的分化(HHEX及SST表達水平增高而GCG 、INS表達下降)。最終，在后前腸期-胰腺內(nèi)胚層聯(lián)合使用FGF7(50ng/ml)與FGF2(20ng/ml)可以顯著促進后前腸期細胞向δ細胞的定向分化，其分化效率是未加FGF組的4.3倍左右(分化效率由6.9%提高至29.6%)。
免疫熒光染色及流式分選鑒定分化的δ細胞(SC-δ)表現(xiàn)為SST+和HHEX+并且NKX6.1-，形態(tài)學上通過透射電鏡觀察看到包裹SST的致密囊泡呈帶狀聚集在SC-δ胞質(zhì)中，這些特點與成人胰島δ細胞表型相符。隨后，將分化至胰腺內(nèi)分泌前體細胞和成熟的SC-δ細胞階段的樣本進行Bulk RNA-seq測序，顯示FGF7與FGF2聯(lián)用能夠抑制肝和腸系細胞的發(fā)育(TBX3和NR5A2 下調(diào))而促進胰腺內(nèi)分泌前體細胞和δ細胞分化(PDX1和FGFR1上調(diào))。單細胞測序分析進一步揭示干細胞衍生的SC-δ細胞與成人胰島δ細胞的轉(zhuǎn)錄組近似，并且表達相關(guān)的離子通道基因。
體外和體內(nèi)實驗進一步證明干細胞衍生的δ細胞具有功能性。與人成熟δ細胞相似，SC-δ細胞在KCL(30mM)、高糖(20mM glucose)、K+離子通道抑制劑Tolbutamide(10mM)刺激下都能夠促進SC-δ細胞分泌SST。同時，SC-δ細胞能夠抑制與其共培養(yǎng)的β細胞的胰島素分泌(在SSTR抑制劑CYN-154806(200nM)存在情況下INS的分泌高于未加抑制劑組的1.5倍)。胰腺δ細胞以Ca2+通道依賴的方式分泌SST，這涉及細胞外Ca2+的內(nèi)流和細胞內(nèi)Ca2+振蕩，以響應(yīng)高葡萄糖反應(yīng)。因此，Ca2+峰值動態(tài)反映了δ細胞的功能成熟度。
研究團隊對分化的SC-δ細胞(SST-P2A-mCherry報告系)進行了鈣成像檢測，發(fā)現(xiàn)部分細胞在高葡萄糖(20G)下表現(xiàn)出動態(tài)鈣振蕩。為了進一步研究這些細胞的體內(nèi)功能，將分選的SC-δ細胞(300萬/小鼠)移植到裸鼠的腎包膜中。移植6周后，通過SST和CHGA免疫染色顯示，大多數(shù)SC-δ細胞仍然存活。葡萄糖耐量測試顯示移植SC-δ細胞的小鼠出現(xiàn)一定程度的葡萄糖耐量升高，同時在葡萄糖負荷20分鐘后，移植SC-δ細胞的小鼠的SST明顯升高，而INS分泌減少。這些數(shù)據(jù)表明分化的SC-δ細胞在體內(nèi)能夠抑制β細胞的胰島素分泌功能。
總結(jié)
本研究提供了一種由多能干細胞體外高效定向誘導分化為δ細胞的方法。通過FGF2和FGF7聯(lián)合促進胰腺內(nèi)分泌細胞分化及δ細胞轉(zhuǎn)錄激活因子的特異性表達，從而促進δ細胞的分化。本研究也進一步揭示了人成纖維細胞生長因子可能通過不同信號通路差異性地調(diào)控胰島內(nèi)分泌細胞的發(fā)育。本研究不僅為δ細胞的基礎(chǔ)研究和糖尿病治療藥物開發(fā)提供重要資源，也將促進以胰島細胞替代治療為基礎(chǔ)的糖尿病再生醫(yī)學的臨床轉(zhuǎn)化研究。
長時間的FGF7處理會誘導CST和HHEX表達，從而增加δ細胞的生成。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-50611-7