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近日，智利安第斯大學(xué)的科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在Journal of Nanobiotechnology上發(fā)表了一項(xiàng)題為"Clinical?grade extracellular vesicles derived from umbilical cord mesenchymal stromal cells: preclinical development and first?in?human intra?articular validation as therapeutics for knee osteoarthritis"（臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞臨床級(jí)外泌體：臨床前開(kāi)發(fā)和首次人類關(guān)節(jié)內(nèi)驗(yàn)證作為膝骨關(guān)節(jié)炎的治療）的研究。
在此次研究中，研究團(tuán)隊(duì)借助多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（UC - MSC）衍生的外泌體（sEV）開(kāi)展了全面探究。研究?jī)?nèi)容涵蓋其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效、安全性，以及深入挖掘其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，致力于為膝骨關(guān)節(jié)炎的治療開(kāi)辟全新路徑。
01 骨關(guān)節(jié)炎
骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，簡(jiǎn)稱OA），作為一種常見(jiàn)且呈進(jìn)行性發(fā)展的多因素關(guān)節(jié)疾病，是引發(fā)慢性疼痛與導(dǎo)致殘疾的關(guān)鍵因素之一。在眾多受影響的關(guān)節(jié)中，膝蓋堪稱OA侵襲最為嚴(yán)重的部位，全球近4/5的OA病例都發(fā)生在膝關(guān)節(jié)。目前，針對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎，尚無(wú)能夠延緩軟骨退化或恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨功能的治療手段?，F(xiàn)有治療方案主要依靠多模式方法，目的在于控制疼痛和緩解關(guān)節(jié)僵硬癥狀 。
OA的顯著特征包括慢性滑膜炎和軟骨退化，越來(lái)越多的新證據(jù)顯示，滑膜炎先于軟骨退化出現(xiàn)。在滑膜組織中，巨噬細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，促炎性M1亞型巨噬細(xì)胞釋放的IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，會(huì)引發(fā)、維持和放大炎癥；而具有抗炎表型的M2巨噬細(xì)胞分泌的IL-10，則對(duì)組織修復(fù)和炎癥消退至關(guān)重要。在OA患者體內(nèi)，滑膜炎表現(xiàn)為產(chǎn)生活性氧（ROS）的M1巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，ROS會(huì)導(dǎo)致炎癥、基質(zhì)失調(diào)和軟骨損傷，氧化應(yīng)激還會(huì)誘導(dǎo)初級(jí)軟骨細(xì)胞凋亡。因此，控制炎癥和氧化應(yīng)激成為OA治療的關(guān)鍵策略。
間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）及其分泌的sEV在OA治療方面展現(xiàn)出了潛力。MSC-sEV具有與細(xì)胞相似的組織再生能力，且作為無(wú)細(xì)胞治療方案，安全性更高。在OA動(dòng)物模型中，MSC-sEV療法已顯示出促進(jìn)軟骨再生、減緩OA進(jìn)展的效果。而臍帶（UC）來(lái)源的 MSC，因其具有較強(qiáng)的軟骨形成能力、體外抑制T細(xì)胞增殖能力，以及相對(duì)較低的血管生成特性，被認(rèn)為是治療OA最具潛力的MSC來(lái)源。基于此，研究團(tuán)隊(duì)旨在開(kāi)發(fā)一種基于UC-MSC衍生sEV的臨床級(jí)療法，并對(duì)其療效和安全性進(jìn)行評(píng)估。
02 研究數(shù)據(jù)
在此次科研探索中，研究團(tuán)隊(duì)旨在開(kāi)發(fā)一種基于UC-MSC衍生sEV的臨床級(jí)療法，并深入探究其療效與安全性。
為此，研究人員針對(duì)非cGMP條件下UC - MSC衍生的sEV開(kāi)展了全方位的特征剖析。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)批次的sEV呈現(xiàn)出一致的miRNA和蛋白質(zhì)譜，這一關(guān)鍵成果為后續(xù)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，極大地提升了UC- MSC衍生sEV療法邁向臨床應(yīng)用的可行性。
UC-MSC分泌具有獨(dú)特和可復(fù)制的分子貨物的sEV
體外實(shí)驗(yàn)
在體外實(shí)驗(yàn)中，sEV展現(xiàn)出了軟骨保護(hù)活性。研究團(tuán)隊(duì)建立了極化的人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（hmMΦs）模型，通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，sEV處理后的hmMΦs中，M1促炎標(biāo)記物（CD86、HLA-DR）表達(dá)降低，M2抗炎標(biāo)記物（CD206、CD163）表達(dá)升高；ELISA 檢測(cè)顯示，巨噬細(xì)胞分泌的抗炎因子IL-10增多，促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β減少。
不僅如此，在甲萘醌誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)里，sEV能夠切實(shí)有效地對(duì)軟骨細(xì)胞起到保護(hù)作用，使得凋亡/死亡細(xì)胞的比例大幅降低。并且，基于LDH釋放的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，sEV對(duì)軟骨細(xì)胞并未表現(xiàn)出明顯的毒性。
這一系列體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)了sEV在軟骨保護(hù)方面具備積極且有效的作用。
sEV驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞極化并發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的軟骨保護(hù)活性
小鼠實(shí)驗(yàn)
在小鼠實(shí)驗(yàn)階段，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎（CIOA）小鼠模型，并進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)給藥sEV的臨床前實(shí)驗(yàn)。利用μCT圖像分析發(fā)現(xiàn)，接受sEV治療的小鼠膝關(guān)節(jié)骨密度（BMD）值和骨表面積與骨體積比（BS/BV）指數(shù)改善。同時(shí)，Safranin O/Fast green染色結(jié)果有力地證實(shí)了sEV對(duì)軟骨的保護(hù)功效，其對(duì)應(yīng)的組織學(xué)評(píng)分更低。
此外，對(duì)小鼠膝后淋巴結(jié)的檢測(cè)結(jié)果顯示，sEV具有抑制炎癥的作用，能夠?qū)?em>CD4+T細(xì)胞群進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)為減少促炎細(xì)胞數(shù)量，增加調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞）的比例。而生物分布測(cè)定結(jié)果表明，在注射DiR染色的sEV后，sEV能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地存在于小鼠的膝關(guān)節(jié)間隙內(nèi)。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，sEV在改善小鼠骨關(guān)節(jié)炎癥狀、保護(hù)軟骨以及調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著積極作用，為其后續(xù)應(yīng)用于臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù) 。
sEV降低骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度并促進(jìn)小鼠體內(nèi)模型的骨關(guān)節(jié)炎再生
人體臨床試驗(yàn)
在首次人體臨床試驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)將臨床級(jí)UC-MSC-sEV注入膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)內(nèi)。結(jié)果顯示，給藥前和治療1年后，患者的臨床評(píng)分指數(shù)（WOMAC指數(shù)）降低，癥狀得到改善，且未觀察到任何不良反應(yīng)。第三方核磁共振檢查通過(guò)SPAIR和WATSc序列評(píng)估發(fā)現(xiàn)，患者軟骨無(wú)退化跡象，這證明了首次sEV人體關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的初步安全性。
基于此，研究團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)了進(jìn)一步的1期臨床試驗(yàn)。在后續(xù)試驗(yàn)計(jì)劃中，患者將分別接受低、中、高三種不同劑量（分別為 2±0.5E + 9 particles/3 mL，6±0.5E + 9 particles/3 mL，20±0.5E + 9 particles/3 mL）的sEV治療，并對(duì)患者進(jìn)行為期1年的隨訪觀察。值得一提的是，這些前期試驗(yàn)結(jié)果在2019年開(kāi)展的1/2期隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)以及1期劑量遞增臨床試驗(yàn)中均得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。
1. sEV的攝取研究
為深入探究sEV的攝取機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)利用sEV示蹤試劑對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而觀察sEV進(jìn)入骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞系的動(dòng)態(tài)過(guò)程。當(dāng)裝載miRNA的sEV進(jìn)入細(xì)胞后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，sEV不僅能夠順利進(jìn)入細(xì)胞，而且攜帶了具有生物學(xué)功能的貨物，為其發(fā)揮治療作用奠定了基礎(chǔ)。
2. 巨噬細(xì)胞極化和軟骨細(xì)胞保護(hù)研究
研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，MSC-sEV具有驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞極化的獨(dú)特功能。它能夠顯著增加具有抗炎活性的M2極化巨噬細(xì)胞的比例，同時(shí)促使M2巨噬細(xì)胞分泌更多的白細(xì)胞介素-10（IL-10）。IL-10對(duì)組織修復(fù)和炎癥消退具有積極作用，進(jìn)而在氧化應(yīng)激環(huán)境中有效保護(hù)軟骨細(xì)胞，為OA的治療提供了新的作用途徑。
3. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)深入分析了MSC-sEV RNA中16種常見(jiàn)miRNAs的富集模式，并對(duì)其調(diào)控的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體（GO）分析。通過(guò)這一研究，成功揭示了多個(gè)與巨噬細(xì)胞和炎癥過(guò)程密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程以及推定靶基因，為進(jìn)一步理解MSC-sEV的作用機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。
4. 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)
為了在體內(nèi)環(huán)境下驗(yàn)證MSC-sEV的治療效果，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了關(guān)節(jié)炎小鼠模型，并通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)給予MSC-sEV的方式進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，利用微計(jì)算機(jī)斷層掃描（μCT）技術(shù)，對(duì)關(guān)節(jié)區(qū)域的骨密度進(jìn)行精確分析，以此評(píng)估關(guān)節(jié)再生和軟骨修復(fù)情況。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為MSC-sEV在OA治療方面的潛在應(yīng)用提供了有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
5. 免疫抑制活性和穩(wěn)定性研究
在探究MSC-sEV的免疫抑制活性及穩(wěn)定性方面，研究團(tuán)隊(duì)向小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSC-sEV，隨后檢測(cè)CD4+IL-17+細(xì)胞和CD4+IFN-γ+細(xì)胞水平，以此評(píng)估其免疫抑制活性。同時(shí)，通過(guò)sEV示蹤分析，確定sEV在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSC-sEV能夠在關(guān)節(jié)腔內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，并持續(xù)發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。
6. 存儲(chǔ)穩(wěn)定性驗(yàn)證
考慮到MSC-sEV未來(lái)商業(yè)化和臨床應(yīng)用的需求，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)其進(jìn)行了存儲(chǔ)穩(wěn)定性驗(yàn)證。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，確保MSC-sEV在存儲(chǔ)過(guò)程中，其質(zhì)量和活性能夠得到有效維持，為其后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用提供了重要保障。
7. 首次人體1期臨床研究設(shè)計(jì)
為了將MSC-sEV推向臨床應(yīng)用，研究團(tuán)隊(duì)精心設(shè)計(jì)了首次人體MSC-sEV給藥的1期臨床研究。在研究設(shè)計(jì)中，明確劃分了不同劑量組，并確定了隨訪時(shí)間，為后續(xù)大規(guī)模臨床試驗(yàn)的開(kāi)展提供了科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊罁?jù)，推動(dòng)了MSC-sEV從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床治療的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。
sEV在體內(nèi)具有免疫抑制活性并維持在膝關(guān)節(jié)間隙內(nèi)
通過(guò)多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，該研究全面評(píng)估了UC-MSC衍生的sEV治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效、安全性及潛在作用機(jī)制。首次對(duì)臨床級(jí)產(chǎn)品進(jìn)行了人體關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的安全性評(píng)估，確定了非cGMP條件下UC-MSC來(lái)源sEV的完整特征，以及標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝的可行性。
研究充分證實(shí)了UC-MSC-sEV作為關(guān)節(jié)內(nèi)給藥療法的再生和抗炎特性，以及良好的安全性。后續(xù)計(jì)劃開(kāi)展的不同劑量sEV治療的1期臨床研究，將進(jìn)一步探索其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的最佳方案，為未來(lái)sEV在膝骨關(guān)節(jié)炎治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。