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干細(xì)胞是一類具有無限或者永生自我更新能力的細(xì)胞，可以分化成任意細(xì)胞、組織或者器官。按照分化能力的不同，干細(xì)胞可以分為全能干細(xì)(totipotent stem cells, TotiSCs)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells, PSCs)和單能干細(xì)胞(unipotent stem cells, USCs)。
而誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)是指利用病毒或非病毒載體技術(shù)對(duì)已分化的成體細(xì)胞進(jìn)行重編程所獲得的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，其自2006年被日本京都大學(xué)山中伸彌團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)以來，至今已有超17年的發(fā)展歷史。
經(jīng)基因工程改造后，iPSC可用于自體/異體T細(xì)胞療法或NK細(xì)胞療法，以及心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)元等功能性細(xì)胞再生，適應(yīng)癥包括腫瘤免疫治療、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝系統(tǒng)疾病、組織損傷修復(fù)等領(lǐng)域。
不過，盡管iPSC衍生細(xì)胞產(chǎn)品具有許多優(yōu)勢(shì)，但在臨床轉(zhuǎn)化上仍然面臨著不小的挑戰(zhàn)，包括致瘤性、免疫原性與異質(zhì)性。其中，iPSC可能導(dǎo)致的成瘤致瘤性被認(rèn)為是iPSC衍生細(xì)胞治療療法面臨的不得不解決的一大挑戰(zhàn)。
致瘤性來源
iPSC的增殖潛力與其致瘤性是iPSC的一體兩面。iPSC無限增殖的潛力使其能夠?yàn)榛颊咭浦矞?zhǔn)備數(shù)十億種不同類型的人體細(xì)胞，但是如果細(xì)胞在移植后繼續(xù)進(jìn)行過度增殖，就有可能導(dǎo)致腫瘤形成。
1、未分化/未成熟細(xì)胞引起的致瘤性
多能干細(xì)胞治療中最嚴(yán)重的問題無疑是畸胎瘤的形成。未成熟畸胎瘤比典型的成熟畸胎瘤或者其他類型的腫瘤更具侵襲性，即使是少量未分化的iPSC也可能會(huì)導(dǎo)致畸胎瘤或者其他腫瘤的形成，當(dāng)然持續(xù)增殖的分化子代細(xì)胞也是畸胎瘤形成的可能原因。此外，如果移植物中存在譜系特異性干細(xì)胞，它們可能由于不正確或不完整的模式而形成腫瘤。
2022年5月，Stem Cells and Development上發(fā)表了一篇論文，報(bào)告了第一例iPSC來源細(xì)胞治療2型糖尿病后形成未成熟畸胎瘤的臨床病例。未成熟畸胎瘤具有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛力，比典型的成熟畸胎瘤更具侵襲性。
2、重編程因子引起的致瘤性
這是iPSC移植所特有的風(fēng)險(xiǎn)。常用的iPSC重編程方法有化學(xué)方法、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染，而在生產(chǎn)iPSC的過程中，需要通過多種轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)，包括Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc等迫使體細(xì)胞表達(dá)與多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，RARg、LRH1、ASF1、p53等也可以增加重編程效率。其中，c-Myc是人類癌癥中最常見的突變基因之一，通常起驅(qū)動(dòng)作用，p53在發(fā)生顯性陰性突變體時(shí)也會(huì)致瘤。因此，這些致癌轉(zhuǎn)基因的整合可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤生成。
3、基因突變引起的致瘤性
基因變異引起腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)在多能干細(xì)胞和其他任何體外擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞中都會(huì)出現(xiàn)。這種情況也是最難以克服的情況：細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不可避免地會(huì)引入突變。核型分析、芯片檢測(cè)、二代測(cè)序等技術(shù)能夠?qū)σ浦睬凹?xì)胞進(jìn)行很好地變異檢測(cè)，避免異常細(xì)胞用于細(xì)胞治療。但是突變來源，以及突變帶來的影響，還不能很好地進(jìn)行解釋說明。
日本Masayo Takahashi團(tuán)隊(duì)成功將iPSC來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植到了一名患者的右眼中后，正準(zhǔn)備進(jìn)行第二例手術(shù)時(shí)意外在患者的iPSCs和RPE細(xì)胞發(fā)現(xiàn)兩個(gè)微小的基因突變；2015年，山中伸彌報(bào)告稱，第二例患者所培養(yǎng)的iPSC細(xì)胞有六個(gè)基因突變，包括一個(gè)與癌癥相關(guān)基因，盡管該基因突變并不直接致癌，但這也使得臨床研究更為謹(jǐn)慎。
還有一個(gè)關(guān)鍵問題尚不清楚，iPSC重編程本身是否具有誘變性，仍需要進(jìn)一步的研究與確認(rèn)。必須承認(rèn)的是，并非所有癌基因突變都是致病的。即使是健康的個(gè)體也存在著癌基因的突變，從而增加了風(fēng)險(xiǎn)分析的復(fù)雜性。
解決方案
實(shí)際上，這一領(lǐng)域的研究人員從未停止過探索，研究防止畸胎瘤以及其他腫瘤生成的策略，這些安全性研究和相關(guān)的質(zhì)量控制貫穿了iPSC細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)全過程，包括從iPSC細(xì)胞株的克隆選取和細(xì)胞庫(kù)的建立、中間生產(chǎn)環(huán)節(jié)、對(duì)物料的質(zhì)量控制和雜質(zhì)分析以及臨床前安全評(píng)價(jià)等。
1、優(yōu)化重編程方案，降低iPSCs的體內(nèi)致瘤能力
在誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的Yamanaka四因子中，原癌基因c-Myc被認(rèn)為與iPSCs致瘤性關(guān)系密切，通過尋求無c-Myc或替代c-Myc的轉(zhuǎn)錄因子組合能有效降低iPSCs在體內(nèi)的致瘤性。
研究證明，化學(xué)小分子能替代c-Myc或者其他因子，在提升重編程效率的同時(shí)，也降低了致瘤性。鄧宏魁研究組首次利用小分子化合物將體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞(chemically iPSC，CiPSC)，在降低致瘤可能的同時(shí)開辟了一條新的途徑實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程。利用純化學(xué)小分子組合進(jìn)行體細(xì)胞重編程的方法也獲得成功。該方法減少了由于外源基因插入可能導(dǎo)致的基因組改變及人工導(dǎo)入癌基因的機(jī)會(huì)，也相應(yīng)降低了腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
2、加強(qiáng)純化與篩選，提供多樣性選擇
想要減少畸胎瘤發(fā)生，首先要建立有效的體外定向分化方法，其次要形成更嚴(yán)格的純化程序去除未分化的細(xì)胞，仔細(xì)嚴(yán)格篩選iPSC細(xì)胞系移植，通過抑制細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵信號(hào)通路抑制未成熟神經(jīng)祖細(xì)胞的致瘤性。
目前，流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)和磁珠分選(magnetically activated cell sorting，MACS)仍然是應(yīng)用最廣的細(xì)胞純化方法。一些新的磁珠分選技術(shù)(如SpheriTech beads)可以將純化過程對(duì)細(xì)胞活性的影響控制在較低程度。目前還開發(fā)出了利用高分子材料(如PDEGMA)應(yīng)用于iPSCs的篩選的技術(shù)體系。
除了體外策略，研究人員能夠通過鑒定和標(biāo)記未分化細(xì)胞標(biāo)記物，在體內(nèi)監(jiān)測(cè)殘余的未成熟細(xì)胞，最大限度地保證iPSC治療產(chǎn)品的安全性，即時(shí)監(jiān)控風(fēng)險(xiǎn)來觀察、防止患者體內(nèi)腫瘤的生成。
3、應(yīng)用“自殺基因系統(tǒng)”去除致瘤性細(xì)胞
研究證明，在體細(xì)胞重編程體系中引入“自殺基因系統(tǒng)”可以有效去除重編程過程中產(chǎn)生的“危險(xiǎn)細(xì)胞”。盡管應(yīng)用于臨床細(xì)胞治療的基于小分子誘導(dǎo)的“自殺基因系統(tǒng)”并不多，但最近開發(fā)出了利用誘導(dǎo)性caspas-9(iCASP9)構(gòu)建的“自殺基因系統(tǒng)”，已被證明其在臨床試驗(yàn)中是有效的和安全的，不過，在去除iPSC生產(chǎn)過程中“危險(xiǎn)細(xì)胞”的可行性仍需進(jìn)一步確認(rèn)。
4、優(yōu)化載體選擇及遞送系統(tǒng)
一些非整合病毒載體的應(yīng)用和非病毒轉(zhuǎn)染(mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo))先后成功應(yīng)用于體細(xì)胞重編程，但轉(zhuǎn)染效率低限制了其在臨床方面的進(jìn)一步應(yīng)用。有報(bào)道稱非整合型的自我復(fù)制RNA(self-replicating RNA，srRNA)系統(tǒng)，因?yàn)槠漭^高的重編程效率和安全性，將有望得到廣泛應(yīng)用。另外，用納米材料開發(fā)的基因遞送系統(tǒng)也應(yīng)用于體細(xì)胞重編程領(lǐng)域。
5、建立可靠的、系統(tǒng)性的安全性評(píng)估體系
現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)尚未有針對(duì)iPSC誘導(dǎo)分化產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床申報(bào)標(biāo)準(zhǔn)形成，但在iPSC真正應(yīng)用于臨床之前，需要建立可靠的、系統(tǒng)性的、貫穿整個(gè)產(chǎn)品生產(chǎn)全過程的安全性評(píng)估體系，包括多能干細(xì)胞殘留檢測(cè)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物長(zhǎng)期致瘤性實(shí)驗(yàn)等對(duì)成瘤性及致瘤性進(jìn)行的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。生產(chǎn)企業(yè)需要嚴(yán)格把控生產(chǎn)工藝與質(zhì)量，能夠達(dá)到設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞產(chǎn)品才能放行。
目前已經(jīng)提出了多個(gè)可以作為安全性評(píng)價(jià)的指標(biāo)，其中iPSC及相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)品的基因組穩(wěn)定性、癌基因突變檢測(cè)等評(píng)價(jià)指標(biāo)均與致瘤性相關(guān)，也是評(píng)估體系中必不可少的評(píng)價(jià)指標(biāo)。不過，在選擇檢測(cè)方法時(shí)，檢測(cè)費(fèi)用、數(shù)據(jù)分析的工作量以及結(jié)果解析的復(fù)雜性等都需要納入考慮范圍，并且可能需要在實(shí)踐中不斷完善改進(jìn)。
實(shí)際上，所有需要進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞制品都存在致瘤性或者成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)，并不僅僅是iPSC獨(dú)有的問題，不過，其增殖分化的潛力使得iPSC的風(fēng)險(xiǎn)更為值得關(guān)注，如果最終的衍生細(xì)胞產(chǎn)品是成熟的終端細(xì)胞且分化完全，經(jīng)過純化和篩選之后沒有高于限度的多能性細(xì)胞殘留，iPSC的致瘤性比用高分裂能力的原代干細(xì)胞可能性更低。
小編總結(jié)
總體而言，iPSC在細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)及其他領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。但作為細(xì)胞治療領(lǐng)域的萌新，iPSC從理論到實(shí)踐仍有很多成長(zhǎng)的空間。
要想成功突破目前的局限，iPSC必須要解決致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。隨著安全性的不斷提高與驗(yàn)證、市場(chǎng)監(jiān)管不斷完善，越來越多的致瘤性相關(guān)研究將使iPSC技術(shù)超越藥物篩選、疾病建模和細(xì)胞/組織再生的傳統(tǒng)領(lǐng)域，在不久后的將來，致瘤性將不再是iPSCs應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)以及衍生細(xì)胞免疫療法的主要挑戰(zhàn)。