本篇作為這一系列討論的最終章,將重點論述這類iPSC-MSC在產(chǎn)品商業(yè)化開發(fā)過程中的策略,包括開發(fā)功能增強型產(chǎn)品及衍生細胞及生物制品的主體研究思路及注意事項,在開發(fā)先進治療藥物(ATMP)過程中需重點關注的問題進行探討。
ATMP研發(fā)思路不論是將MSC還是iMSC細胞開發(fā)成一款先進治療產(chǎn)品,其成藥過程的核心問題在于如何開展藥物制造工藝的研發(fā)以及如何實現(xiàn)干細胞藥物良好的質(zhì)量控制。制藥企業(yè)需要基于質(zhì)量源于設計(Quality by Design, QbD)的理念,以合理的科學和質(zhì)量風險管理為依據(jù),起始于預定的質(zhì)量目標,注重對MSC/iMSC產(chǎn)品和其工藝的理解和對生產(chǎn)工藝過程控制系統(tǒng)的研發(fā)方法(ICHQ8)。
企業(yè)研發(fā)人員還需要基于風險評估,識別直接影響產(chǎn)品安全性和有效性的關鍵質(zhì)量屬性(Critical Quality Attribute,CQA),找到關鍵工藝參數(shù)(Critical Process Parameter,CPP),開發(fā)出設計空間(design space)來量化參數(shù)的可變性對質(zhì)量屬性的影響,隨后開發(fā)控制策略(control strategy)以維持工藝參數(shù)從而保證產(chǎn)品質(zhì)量,并且放大規(guī)模進行工藝驗證。
MSC/iMSC產(chǎn)品開發(fā)過程中的困難點包括:如何建立符合GMP標準的實驗方案,影響原料選擇的因素,細胞擴增到制劑配方,建立質(zhì)量控制(QC)參數(shù),以及符合GMP要求的質(zhì)量標準[1]。MSC產(chǎn)品的關鍵質(zhì)量參數(shù)(CQA)包括對MSC產(chǎn)品的鑒定、純度、生物學效力和安全性等四大維度。此外關于iMSCs和組織來源MSCs在再生、分化和免疫調(diào)節(jié)能力的比較仍需要更多的研究工作。在開發(fā)iMSC產(chǎn)品時,還需要額外關注產(chǎn)品的異質(zhì)性,可以進一步通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序方法分析iMSC細胞不同亞群情況。另外因為工藝上游的iPSC種子細胞具有潛在的成瘤風險,因此需要開發(fā)穩(wěn)定且高靈敏度的iPSC殘留及非預期分化細胞殘留的檢測方法,來證明終產(chǎn)品不具有成瘤性[2]。
相比于原代來源的MSCs,iMSC產(chǎn)品會經(jīng)過較長時間的體外培養(yǎng)和傳代過程,需通過全基因組測序,關注iMSC產(chǎn)品的遺傳學安全性。通過規(guī)范標準化質(zhì)量控制程序,建立制造標準,確保不同來源的間充質(zhì)干細胞或不同分化路徑的iMSC細胞具有一致的質(zhì)量和效力,從而提高產(chǎn)品的一致性、可靠性和安全性,促進其向GMP級臨床應用產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化。
基因改造的iMSC二代產(chǎn)品開發(fā)目前iPSC及其衍生產(chǎn)品的商業(yè)化用途的主要領域包括細胞治療、疾病建模、藥物開發(fā)及發(fā)現(xiàn)、個性化醫(yī)療和毒理學篩查等。結(jié)合該類產(chǎn)品的研發(fā)和市場表現(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)iMSC產(chǎn)品除了具備制備過程簡單、細胞來源一致、均一性好、適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點外,還更方便從種子細胞進行基因改造,從而打造iPSC衍生細胞的二代產(chǎn)品。已有研究報道,特異性編輯iPSC細胞形成的CAR-iPSC可作為種子細胞用于穩(wěn)定的CAR-NK細胞生產(chǎn)[3]。
CRISPR/Cas9基因編輯技術也可廣泛用于MSCs的基因改造[4]。對MSC細胞進行基因修飾,可使其脫離外源因子刺激,提高其治療潛力。多種基因的持續(xù)性表達增強能夠顯著提高MSC的療效。在不同適應癥中,不同基因發(fā)揮的功能存在顯著差異。MSC的治療效果高度依賴于體內(nèi)遷移與歸巢能力,遷移能力與MSC上表達的趨化因子受體和組織中的趨化因子相關。
其中一個功能增強的基因改造方向為過表達MSC上的特定趨化因子受體(如CCR1和CXCR2)。另外有報道包括IL-4、IL-10、TGF-β1、GATA-4和CXCR4基因都有提高干細胞活率,增強療效的作用[5]。BM-MSCs過表達VEGF會促進血管生成并改善腦梗死,提高細胞活率并增強旁分泌效應[6]。為實現(xiàn)低氧預處理效果,將HIF-1α轉(zhuǎn)染至BM-MSCs可模擬其在低氧暴露下更強的治療效果[7]。
然而,將基因改造操作應用于原代間充質(zhì)干細胞,需要經(jīng)過長期培養(yǎng)與篩選,難以避免會造成細胞的復制性衰老,降低MSC的治療效果,并不適用于實際臨床應用與細胞治療產(chǎn)品的開發(fā)。
因此,針對特定適應癥選擇適合的基因,對作為分化起始的種子iPSC進行有功能的基因編輯后,再進一步誘導分化形成iMSC,能夠幫助研究者獲得特定基因穩(wěn)定改造的且異質(zhì)性低的iMSC細胞。這一操作有助于開發(fā)功能增強型的iPSC衍生二代產(chǎn)品,然而對某種基因的持續(xù)性激活或敲減,仍需經(jīng)過長期復雜的前期論證,以確定該產(chǎn)品的安全性。iMSC衍生產(chǎn)物-外泌體(iMSC-EVs)作為先進療法可能性間充質(zhì)干細胞釋放的外泌體(MSC-Exos)在免疫調(diào)節(jié)和組織再生方面具有廣泛的應用前景。
外泌體主要功能可分為組織修復和抗纖維化,具有多種類型適應癥(如膝骨關節(jié)炎、脊髓損傷、皮膚損傷、肝腎肺組織纖維化、神經(jīng)相關疾病等)的治療潛力[8]。一系列臨床前研究結(jié)果也證明,與MSC-EVs的生物學功能相類似,iMSC來源的EVs對多種適應癥也有很好的治療效果[9]。目前EVs作為藥物開發(fā)的核心難點主要體現(xiàn)在兩方面:外泌體來源細胞的異質(zhì)性造成的批間差和大規(guī)模生產(chǎn)及純化的可操作性。而iMSCs來源于一株均一的iPSC種子,可以通過工藝前期篩選合適的iPSC細胞株,通過穩(wěn)定的分化工藝獲得同質(zhì)性很高的iMSC,以這些細胞為來源制備外泌體,直接克服了原代細胞的異質(zhì)性,保證了產(chǎn)品較小的批間差。
另外通過恰當?shù)闹苽涔に嚝@得的iMSC產(chǎn)品,能夠保證細胞持續(xù)且強的體外擴增能力,從而通過直接放大上游種子細胞規(guī)模而擴大EVs的生產(chǎn)規(guī)模。除此以外,從提高EVs的濃度、靶向性和負載功能分子等方面,也能夠提高iMSC-EVs的藥效??梢酝ㄟ^3D工藝在反應器規(guī)模培養(yǎng)灌流或批培養(yǎng)iMSC,加快細胞生長速率從而加快外泌體的分泌;或者使用小分子藥物預處理iMSC,調(diào)控并增加外泌體的分泌量;也可以通過基因改造iMSCs,使特異性靶點分子與外泌體表面的蛋白融合表達,增強外泌體對功能分子的負載[10]。
對于外泌體產(chǎn)品,需要嚴格參考國際標準(ISO 24603)中對外泌體相關的研究規(guī)范,從而規(guī)范外泌體生產(chǎn)的上游步驟。近期在中國也發(fā)布了兩項團體標準,《人多能干細胞來源的小細胞外囊泡》(T/CRHA 002-2021)及《人間充質(zhì)干細胞來源的小細胞外囊泡》(T/CRHA 001-2021),在產(chǎn)品開發(fā)中應關注外泌體關鍵質(zhì)量屬性包括:1、用于生產(chǎn)小細胞外囊泡的人間充質(zhì)干細胞的關鍵質(zhì)量屬性應符合規(guī)定;2、小細胞外囊泡的形態(tài)、粒徑、標志蛋白、純度、免疫調(diào)節(jié)能力、微生物安全性等關鍵質(zhì)量參數(shù)應符合標準;3、詳細的過程控制:詳細記錄小細胞外囊泡的分離方法。在今年10月31日國家藥監(jiān)局發(fā)布的《2024年第二次醫(yī)療器械產(chǎn)品分類界定結(jié)果匯總》中,明確了針對干細胞外泌體為建議不作為醫(yī)療器械管理的產(chǎn)品。
而外泌體究竟能夠以何種“身份”投入市場,用于患者,還需要對外泌體基礎科學研究的不斷深入,對外泌體生產(chǎn)規(guī)范和質(zhì)量標準等法規(guī)的逐步完善,以iMSC來源的EVs會逐漸展現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢,逐漸實現(xiàn)向GMP級產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化與應用。
總結(jié):如本系列文章中匯總的,iPSC-MSC具有優(yōu)越的生物學性狀及很好的治療效果,然而我們必須認識到,影響iMSC成藥的核心決定性因素與MSC是類似的。除了藥學,還包括臨床療效。MSC輸注后患者臨床療效差異較大,關鍵因素在于MSC的體內(nèi)治療機制十分復雜,且目前尚不明確。雖然大量的體外研究結(jié)果公認MSC具有多系分化潛能,能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與抑炎功能,通過旁分泌作用產(chǎn)生細胞因子、外泌體和外囊泡等物質(zhì),或者通過影響線粒體等細胞器轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗纖維化、損傷修復、促進組織再生等功能[11],然而到了人體內(nèi)的變化并不明確。在臨床上,研發(fā)人員仍需要建立療效與生物學活性檢測指標間的相關性。
如果能夠找到關鍵的效應細胞和關鍵作用分子,檢測與作用機制相關的通路,開發(fā)出與產(chǎn)品表征和臨床結(jié)局之間關聯(lián)的分析方法,將顯著提高MSC的成藥概率。在現(xiàn)階段,我國已出臺《人源性干細胞產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則》(試行),對產(chǎn)品的質(zhì)量標準及臨床申報標準進行了規(guī)定,因此在iPSC及其衍生細胞制品真正應用于臨床之前,需要建立可靠、系統(tǒng)性、貫穿整個產(chǎn)品生產(chǎn)全過程的安全性評估體系和放行,包括對終產(chǎn)品多能干細胞殘留檢測、克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗、動物長期致瘤性實驗等,用于嚴格把控生產(chǎn)工藝與產(chǎn)品質(zhì)量。在檢測方法的選擇方面,檢測費用、實驗周期、數(shù)據(jù)分析工作量以及結(jié)果解析的復雜程度都應進行綜合考慮并結(jié)合實踐改進與完善。