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近年來(lái)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）技術(shù)發(fā)展正深刻改變著我們探索大腦奧秘的方式 。研究者們不再僅僅依賴(lài)動(dòng)物模型或有限的患者樣本，而是能夠利用iPSC在培養(yǎng)皿中構(gòu)建出人類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞，甚至是微型的“類(lèi)腦”結(jié)構(gòu)，為理解神經(jīng)系統(tǒng)疾病和開(kāi)發(fā)新療法打開(kāi)了前所未有的大門(mén) 。從最初簡(jiǎn)單的二維細(xì)胞片層，到如今能夠模擬大腦復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的三維神經(jīng)球與類(lèi)腦器官，iPSC神經(jīng)模型的發(fā)展日新月異 。
近期，多篇研究再次刷新了我們對(duì)iPSC潛能的認(rèn)知，將神經(jīng)模型的構(gòu)建與應(yīng)用推向了新的高度。本文將聚焦其中三項(xiàng)代表性成果，首先是來(lái)自美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Rhea Sullivan及其團(tuán)隊(duì)發(fā)表于PLoS One的研究，他們利用iPSC構(gòu)建了中腦神經(jīng)干細(xì)胞模型，以探究產(chǎn)前阿片類(lèi)藥物暴露對(duì)大腦發(fā)育的深遠(yuǎn)影響。緊接著，比利時(shí)安特衛(wèi)普大學(xué)的Sarah De Beuckeleer團(tuán)隊(duì)在eLife上展示了其創(chuàng)新成果，他們開(kāi)發(fā)出一種基于人工智能的圖像分析方法，能夠精準(zhǔn)識(shí)別復(fù)雜神經(jīng)培養(yǎng)物中的不同細(xì)胞類(lèi)型，極大地提升了研究的精確性和效率。最后，美國(guó)國(guó)家神經(jīng)疾病與卒中研究所的Tongguang Wang團(tuán)隊(duì)在JoVE上發(fā)表了他們構(gòu)建含小膠質(zhì)細(xì)胞的人腦類(lèi)器官的新方案，為研究大腦中的免疫反應(yīng)與神經(jīng)炎癥提供了更逼真的平臺(tái)。上述研究反映出iPSC技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域激動(dòng)人心的發(fā)展前景，預(yù)示著我們離攻克神經(jīng)系統(tǒng)頑疾的目標(biāo)又近了一步。
研究亮點(diǎn)
1.iPSC模型首次精細(xì)模擬產(chǎn)前阿片類(lèi)藥物暴露與戒斷對(duì)人中腦神經(jīng)祖細(xì)胞命運(yùn)的具體影響，揭示了藥物干預(yù)發(fā)育的潛在機(jī)制 。
2. AI賦能細(xì)胞識(shí)別，其開(kāi)發(fā)的CNN工具能高精度、無(wú)偏倚地解析復(fù)雜iPSC衍生神經(jīng)培養(yǎng)物組分，提升模型質(zhì)控與分析效率 。
3. 成功構(gòu)建了含內(nèi)源性發(fā)育小膠質(zhì)細(xì)胞的人腦類(lèi)器官，為研究早期神經(jīng)-免疫相互作用及相關(guān)疾病提供了更逼真的平臺(tái) 。
內(nèi)容介紹
01 模擬“孕期風(fēng)險(xiǎn)”：iPSC揭示阿片藥物對(duì)發(fā)育大腦的影響
產(chǎn)前阿片類(lèi)藥物暴露對(duì)新生兒神經(jīng)發(fā)育的潛在危害已成為一個(gè)日益受到關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。為了在細(xì)胞層面探究這一問(wèn)題，來(lái)自賓夕法尼亞州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Sullivan R.團(tuán)隊(duì)巧妙地利用iPSC技術(shù)，構(gòu)建了人源中腦神經(jīng)祖細(xì)胞模型 。他們首先將健康人iPSC分化為中腦區(qū)域的神經(jīng)祖細(xì)胞，這些細(xì)胞是未來(lái)大腦中關(guān)鍵神經(jīng)元（如多巴胺神經(jīng)元）的“種子”。
研究團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化了分化方案，確保這些祖細(xì)胞能充分表達(dá)阿片類(lèi)藥物的關(guān)鍵受體，從而更真實(shí)地模擬藥物作用的靶點(diǎn) 。隨后，他們讓這些細(xì)胞在培養(yǎng)皿中經(jīng)歷慢性嗎啡暴露，并模擬了藥物戒斷的過(guò)程。通過(guò)一系列精密的細(xì)胞和分子生物學(xué)檢測(cè)，他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和單純嗎啡暴露組相比，經(jīng)歷嗎啡戒斷的神經(jīng)祖細(xì)胞表現(xiàn)出環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平的顯著“超射”——這是一種在成熟神經(jīng)元阿片戒斷中常見(jiàn)的生化信號(hào)改變，提示了早期發(fā)育階段神經(jīng)細(xì)胞對(duì)藥物戒斷的敏感性 。
更重要的是，研究揭示了藥物暴露與戒斷對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的深遠(yuǎn)影響。慢性嗎啡暴露似乎“卡住”了神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程，使得更多細(xì)胞停留在未成熟的祖細(xì)胞狀態(tài)（巢蛋白nestin陽(yáng)性細(xì)胞比例增加），而分化成熟的神經(jīng)元（NeuN陽(yáng)性細(xì)胞比例減少）則相應(yīng)減少 。然而，當(dāng)嗎啡被撤去（模擬戒斷）后，情況發(fā)生了逆轉(zhuǎn)：星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，大腦中的重要支持細(xì)胞）的比例下降，而神經(jīng)元的比例則顯著增加，甚至超過(guò)了正常水平 。這一發(fā)現(xiàn)提示，產(chǎn)前阿片類(lèi)藥物的暴露與戒斷可能會(huì)擾亂神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的微妙平衡，對(duì)大腦的早期構(gòu)建產(chǎn)生潛在的長(zhǎng)期影響。盡管該研究未觀察到細(xì)胞增殖和總體活力的顯著變化，但其建立的體外模型為深入研究阿片類(lèi)藥物如何影響早期神經(jīng)發(fā)育中的細(xì)胞命運(yùn)決定提供了寶貴的工具，也為未來(lái)探索干預(yù)策略奠定了基礎(chǔ)（圖1）。
圖1.慢性嗎啡暴露和戒斷改變了譜系特異性中腦祖細(xì)胞最終分化的比例。(a) 采用較長(zhǎng)神經(jīng)誘導(dǎo)和模式化方法獲得的中腦神經(jīng)祖細(xì)胞進(jìn)行慢性嗎啡暴露和戒斷處理的實(shí)驗(yàn)流程。(b) 分化中的神經(jīng)祖細(xì)胞在嗎啡戒斷24小時(shí)后固定并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)cAMP免疫染色 (n=3)。比例尺為300 μm。(c) 使用Biotek Cytation 5對(duì)不同條件下cAMP的平均熒光強(qiáng)度值進(jìn)行量化。與載體組(VEH)和嗎啡暴露組(MOR)相比，戒斷組(WD)細(xì)胞的cAMP平均熒光強(qiáng)度顯著更高 (單因素方差分析，Tukey多重比較，F(xiàn) = 9.411, p = 0.014)。(d) 不同條件下增殖標(biāo)記物Ki67的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有差異 (單因素方差分析，F(xiàn) = 0.2614, p = 0.7783)。(e) 在第56天，對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行固定，并用細(xì)胞身份標(biāo)記物NES（綠色）、GFAP（橙色）和NEUN（紅色）進(jìn)行免疫染色。所有圖像均在10倍鏡下拍攝。比例尺為300 μm。(f) 通過(guò)使用Biotek Cytation 5對(duì)每個(gè)DAPI+細(xì)胞的平均染色強(qiáng)度進(jìn)行閾值設(shè)定來(lái)確定細(xì)胞身份。通過(guò)將NES+、GFAP+或NEUN+細(xì)胞的總數(shù)除以DAPI+細(xì)胞的總數(shù)來(lái)確定比例。在不同處理?xiàng)l件和細(xì)胞標(biāo)記物對(duì)分化細(xì)胞命運(yùn)比例的影響上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的交互作用 (雙因素方差分析，F(xiàn)(4,18) = 16.05, p < 0.0001)。(g) 慢性嗎啡暴露和戒斷并未導(dǎo)致經(jīng)典阿片受體轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化 (雙因素方差分析，F(xiàn)(4,18) = 0.569, p = 0.688)。(h) 在嗎啡戒斷24小時(shí)后，對(duì)活的、未固定的細(xì)胞進(jìn)行LIVE/DEAD™染色。比例尺為300 μm。(i) 不同處理?xiàng)l件下鈣黃綠素-AM (calcein-AM)+ 細(xì)胞的比例沒(méi)有差異 (單因素方差分析，F(xiàn) = 0.292, p = 0.756)。
02 AI慧眼識(shí)細(xì)胞：智能解析復(fù)雜神經(jīng)培養(yǎng)物
隨著iPSC衍生神經(jīng)模型變得越來(lái)越復(fù)雜，例如包含多種神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的混合培養(yǎng)物或三維類(lèi)器官，如何準(zhǔn)確、高效地識(shí)別和量化其中的不同細(xì)胞成分，成為了一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的手動(dòng)計(jì)數(shù)或基于特定標(biāo)記物的分析方法不僅耗時(shí)耗力，有時(shí)還難以應(yīng)對(duì)細(xì)胞密度高、形態(tài)異質(zhì)性大的復(fù)雜情況。針對(duì)這一難題，安特衛(wèi)普大學(xué)的De Beuckeleer S.團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種基于人工智能(AI)的創(chuàng)新解決方案 。
他們的核心技術(shù)是一種結(jié)合了“細(xì)胞繪制”（cell painting，一種多通道熒光成像技術(shù)）和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNNs）的圖像分析方法。研究人員首先使用多種熒光染料對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色，捕捉細(xì)胞的形態(tài)、紋理以及關(guān)鍵蛋白的表達(dá)信息。然后，他們訓(xùn)練CNN模型來(lái)學(xué)習(xí)和識(shí)別不同細(xì)胞類(lèi)型的獨(dú)特“指紋”。令人印象深刻的是，這種AI方法在區(qū)分神經(jīng)母細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系時(shí)，準(zhǔn)確率超過(guò)了96%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的基于形態(tài)紋理特征的隨機(jī)森林分類(lèi)方法。該團(tuán)隊(duì)還提出了一種巧妙的“核中心”（nucleocentric）分析策略。在細(xì)胞非常密集的培養(yǎng)物中，完整地分割出單個(gè)細(xì)胞的輪廓非常困難。而“核中心”方法則將分析重點(diǎn)放在細(xì)胞核及其緊鄰的周邊區(qū)域，利用這部分相對(duì)容易識(shí)別且信息豐富的區(qū)域特征來(lái)進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型的判斷，從而在高密度培養(yǎng)條件下依然保持了高準(zhǔn)確性 。
更具實(shí)際意義的是，該方法成功應(yīng)用于iPSC衍生的真實(shí)神經(jīng)培養(yǎng)物。它不僅能夠準(zhǔn)確評(píng)估培養(yǎng)物的成熟狀態(tài)（區(qū)分神經(jīng)元與祖細(xì)胞的準(zhǔn)確率高達(dá)96%），還能在包含神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜混合培養(yǎng)物中，精確區(qū)分出不同類(lèi)型的細(xì)胞，甚至能夠識(shí)別出小膠質(zhì)細(xì)胞的不同激活狀態(tài)。這項(xiàng)技術(shù)的突破，為iPSC神經(jīng)模型的質(zhì)量控制、成分分析以及高通量藥物篩選提供了強(qiáng)有力的自動(dòng)化工具，有望極大提升研究的可重復(fù)性和細(xì)胞類(lèi)型特異性，加速神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)程(圖2)。
圖2.利用形態(tài)學(xué)分析鑒定誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 細(xì)胞類(lèi)型。(A) iPSC衍生的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在單培養(yǎng)中進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色的代表性圖像。卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (CNN) 對(duì)iPSC衍生的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的單培養(yǎng)物進(jìn)行分類(lèi)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和混淆矩陣（所有模型的平均值）。箱線圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分類(lèi)器（模型初始化，N=9）的F1分?jǐn)?shù)。分類(lèi)器使用三種不同的隨機(jī)種子訓(xùn)練3次。(B) 經(jīng)LPS或?qū)φ仗幚淼膇PSC衍生的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞單培養(yǎng)物的代表性圖像（顏色代碼定義見(jiàn)圖1A）。給出了預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和混淆矩陣（所有模型的平均值）。小提琴圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分類(lèi)器（模型初始化，N=3）的F1分?jǐn)?shù)。(C) iPSC衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元混合培養(yǎng)的代表性圖像。真實(shí)情況通過(guò)免疫熒光染色 (IF) 鑒定。小提琴圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分類(lèi)器（模型初始化）的F1分?jǐn)?shù)。分類(lèi)器使用三種不同的隨機(jī)種子進(jìn)行訓(xùn)練。CNN的結(jié)果與淺層學(xué)習(xí)（隨機(jī)森林，RF）進(jìn)行比較。對(duì)經(jīng)LPS處理或?qū)φ仗幚淼纳窠?jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)物進(jìn)行了相同的分析。采用分層方法，首先將神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞分離，然后對(duì)處理過(guò)和未處理過(guò)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。小提琴圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分類(lèi)器（模型初始化，N=9）的F1分?jǐn)?shù)。分類(lèi)器使用三種不同的隨機(jī)種子訓(xùn)練3次。
03 構(gòu)建“迷你免疫腦”：iPSC類(lèi)器官整合小膠質(zhì)細(xì)胞
腦類(lèi)器官，這些由iPSC在體外三維培養(yǎng)形成的“微型大腦”，為模擬人類(lèi)大腦發(fā)育和疾病提供了前所未有的平臺(tái)。然而，早期的大多數(shù)腦類(lèi)器官模型都缺失了一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞組分——小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中常駐的免疫細(xì)胞，在神經(jīng)炎癥、神經(jīng)感染以及大腦發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持中扮演著至關(guān)重要的角色。如何在類(lèi)器官中整合功能性的小膠質(zhì)細(xì)胞，一直是該領(lǐng)域努力的方向。
美國(guó)國(guó)家神經(jīng)疾病與卒中研究所的Wang T.團(tuán)隊(duì)在這一領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展，他們開(kāi)發(fā)出一種可靠且可重復(fù)的方案，用于生成內(nèi)源性發(fā)育小膠質(zhì)細(xì)胞的人腦類(lèi)器官。其核心策略是在iPSC分化形成胚狀體（類(lèi)器官的早期雛形）的階段，就將iPSC衍生的造血祖細(xì)胞（HPCs，小膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞）整合進(jìn)去。隨后，這些共培養(yǎng)的胚狀體在特定的神經(jīng)誘導(dǎo)、增殖和成熟條件下，逐漸發(fā)育成包含神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的三維腦類(lèi)器官。
通過(guò)免疫染色（檢測(cè)IBA1、TREM2等小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物）和單細(xì)胞RNA測(cè)序等先進(jìn)技術(shù)，研究人員證實(shí)了這些類(lèi)器官內(nèi)確實(shí)存在著由共同引入的HPCs發(fā)育而來(lái)的小膠質(zhì)細(xì)胞。更重要的是，這些整合的小膠質(zhì)細(xì)胞并非“徒有其表”，它們具有正常的生理功能。當(dāng)用脂多糖（LPS，一種能夠模擬細(xì)菌感染并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的物質(zhì)）刺激這些類(lèi)器官時(shí)，其中的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出典型的炎癥反應(yīng)，證明了其免疫活性。有趣的是，即使沒(méi)有在培養(yǎng)基中添加所有已知促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分化的特定細(xì)胞因子，HPCs也能夠在類(lèi)器官的神經(jīng)環(huán)境中成功分化為小膠質(zhì)細(xì)胞 。這表明，發(fā)育中的神經(jīng)微環(huán)境自身就能產(chǎn)生足夠的信號(hào)，引導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的特化和成熟，這使得該模型更接近于體內(nèi)真實(shí)的大腦發(fā)育過(guò)程。這項(xiàng)工作不僅為研究先天免疫系統(tǒng)與發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)之間的早期相互作用提供了寶貴的工具，也為模擬涉及神經(jīng)炎癥或神經(jīng)感染（如阿爾茨海默病、帕金森病、寨卡病毒感染等）的復(fù)雜疾病開(kāi)辟了新的途徑（圖3-4）。
圖3.3D類(lèi)器官中神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫染色。經(jīng)過(guò)透明化處理和免疫染色后，類(lèi)器官顯示小膠質(zhì)細(xì)胞呈IBA1陽(yáng)性染色，神經(jīng)元呈βIII-微管蛋白陽(yáng)性染色。顯示的代表性圖像是在共聚焦顯微鏡下使用20倍物鏡拍攝的。
圖4.含小膠質(zhì)細(xì)胞的3D類(lèi)器官的單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果。(A) 圖表顯示了在未添加額外小膠質(zhì)細(xì)胞分化細(xì)胞因子的類(lèi)器官中，IBA1(AIF1)、TMEM119和MAP2的分布。(B) 在兩個(gè)用額外小膠質(zhì)細(xì)胞分化細(xì)胞因子培養(yǎng)的類(lèi)器官和一個(gè)未用其培養(yǎng)的類(lèi)器官中，對(duì)IBA1和TMEM119陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)。代表性類(lèi)器官中IBA1和TMEM119陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生變化。
未來(lái)展望
未來(lái)，iPSC誘導(dǎo)的神經(jīng)模型依然充滿(mǎn)無(wú)限可能，并將在神經(jīng)科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域持續(xù)發(fā)光發(fā)熱。首先，在模型構(gòu)建方向，科學(xué)家們將致力于提升分化細(xì)胞的“成熟度”，使其更接近成年人的生理狀態(tài)，從而更準(zhǔn)確地模擬晚發(fā)性神經(jīng)退行性疾病 。同時(shí)，構(gòu)建包含更多種類(lèi)細(xì)胞（如血管細(xì)胞、更多類(lèi)型的免疫細(xì)胞）的、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、功能更完善的三維類(lèi)腦器官，將是未來(lái)的重要攻關(guān)方向 。此外，建立標(biāo)準(zhǔn)化的iPSC神經(jīng)細(xì)胞生產(chǎn)和鑒定流程，對(duì)于確保研究結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性，以及滿(mǎn)足大規(guī)模藥物篩選和未來(lái)臨床治療對(duì)細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的需求至關(guān)重要。技術(shù)融合將是驅(qū)動(dòng)未來(lái)發(fā)展的主旋律。AI和機(jī)器學(xué)習(xí)將在分析iPSC模型產(chǎn)生的海量復(fù)雜數(shù)據(jù)（如高內(nèi)涵成像、多組學(xué)數(shù)據(jù)）以及優(yōu)化細(xì)胞分化方案中扮演越來(lái)越重要的角色。
iPSC技術(shù)的發(fā)展也伴隨著生產(chǎn)成本、潛在的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)（即使是自體細(xì)胞也可能在特定情況下發(fā)生）以及長(zhǎng)期安全性和有效性等方面的挑戰(zhàn)，但iPSC技術(shù)及其衍生的神經(jīng)模型無(wú)疑為我們理解和攻克神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來(lái)了前所未有的光明前景。這些不斷進(jìn)化的“掌中大腦”，正以前所未有的深度和廣度，助力科學(xué)家揭示大腦的奧秘。